论文部分内容阅读
【目的】通过对常用生物数据库分析以及临床肿瘤组织验证并结合细胞功能学试验,探讨前脑啡肽(proenkephalin,PENK)在胃肠间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)中的作用与肿瘤恶性行为的关系,明确PENK基因在GIST中高表达与GIST临床危险度分级的关系,初步阐明PENK在胃肠间质瘤中的作用机制及其在GIST伊马替尼耐药细胞株中的功能。【方法】1)通过GEO数据库、Oncomine在线数据库(https://www.oncomine.org)、c Bio Portal(http://www.cbioportal.org)等分析了GIST肿瘤组织标本和配对正常组织标本中基因表达差异。以Fc(Fold chang)值≥2(即表达量增加一倍及以上)同时基因改变以拷贝数扩增(copy number amplification,CNA)为主,CNA≥5%为标准筛选出一组各数据库中均出现的差异基因,结合仁济医院胃肠外科不同危险度分级的GIST新鲜组织标本(高危10例及低、中危各5例)以及14例正常胃组织(其中10例配对高危GIST,2例配对低危GIST,2例配对中危GIST)q RT-PCR结果,我们从中挑选出与正常组织相比肿瘤组织中表达差异较大的基因PENK。同时,比较分析上海交通大学医学院附属仁济医院胃肠外科前期所作的GIST不同危险度GIST组织的表达谱芯片筛查结果,发现PENK基因在中低危GIST中高表达,而在高危GIST中低表达,故拟选择此基因作为研究对象。2)应用上海交通大学医学院附属仁济医院胃肠外科GIST患者肿瘤组织构建的GIST组织芯片(2002.01.01～2011.12.31),通过免疫组织化学方法检测了PENK在不同危险度分级的GIST表达情况,结合相应患者的临床病理资料及术后随访结果,分析PENK蛋白表达与患者临床病理特征和预后的相关性。3)GIST-882、GIST-T1细胞功能实验验证:首先在GIST-882细胞系、GIST-T1细胞系中验证PENK的表达情况,然后通过构建PENK稳转干扰及过表达片段,在GISTT1细胞系中进行了功能验证:通过CCK-8实验和细胞克隆形成实验验证GISTT1细胞的增殖能力;通过划痕实验、Transwell(空穿及胶穿)实验验证GIST-T1迁移、侵袭能力;通过细胞周期及凋亡实验验证其对细胞周期或细胞凋亡的影响;通过构建稳转干扰细胞株并裸小鼠皮下成瘤实验验证PENK在裸小鼠体内对GIST-T1细胞株成瘤能力的影响。4)通过对PENK蛋白纯化和上游调控转录因子预测、下游信号通路激活等方面研究和分析了PENK在GIST进程中的作用机理。5)构建GIST-T1伊马替尼耐药细胞株初步验证了PENK对耐药细胞株的功能。【结果】1)通过对GEO、TCGA、Oncomine中GIST配对资料的数据库中筛选出差异表达的相关基因,以Fc值≥2为界限同时该基因变化以拷贝数扩增为主(CNA≥5%)筛选出在两个数据库中均出现的高表达基因14个(TOX、CHEK1、FOXG1、CEP170、BDNF、KIF1A、PEG10、SATB2、TCF19、MCPH1、SIX1、RFTN2、GNG2、PENK)。2)对14个差异表达基因进行q RT-PCR验证,结果显示PENK正常组织中呈现低表达但在GIST组织中呈现高表达,两组间表达量差异有显著统计学意义,P=0.0188。进一步GIST组间分析,PENK在低、中危组GIST中呈高表达,低、中危组间PENK表达无显著统计学意义,P=0.837;在高危组中呈显著低表达,与正常组织和低中危组相比较均呈现显著地统计学差别,P值分别为0.015和0.00014。3)268例GIST组织芯片的免疫组化染色结果显示PENK在GIST高危组织的阳性表达率为59%,明显低于中低危GIST组织的77.2%,两组间具有显著的统计学差别,P=0.0001。进一步将PENK表达水平与NIH危险度分级相关指标关联,我们发现PENK蛋白表达水平与肿瘤大小(P=0.001)、核分裂相(P=0.0002)、肿瘤破裂出血(P=0.026)、危险度分级(P=0.001)均呈显著负相关。随着GIST肿瘤体积增大(肿瘤破裂出血风险亦随之增高)、肿瘤核分裂相增加及NIH危险度分级增高,GIST肿瘤组织的PENK蛋白染色的阳性率减少,而阴性率显著增加,提示PENK在GIST进展中可能发挥抑癌基因的功能。4)对GIST患者生存情况和疾病复发情况进行分析,发现PENK高表达组GIST患者存活率显著高于低表达组,差异具有显著的统计学意义,P=0.036;在GIST患者疾病复发率上,PENK高表达组显著低于低表达组,差异具有显著的统计学意义,P=0.001。结合患者的术后随访资料绘制生存曲线并进行Logistic回归分析,同样的结论出现在268例按PENK表达水平不同划分的GIST患者中,PENK高表达可显著改善GIST患者的总生存(Overall Survival,OS)和无复发生存(Recurrence Free Survival,RFS),差异有显著统计学意义,P值分别为0.034和0.033,即PENK高表达者预后较好,低表达者预后差。同时按NIH危险度分级(极低危/低危,中危,高危)的268例GIST患者中,在OS方面低危和中危组患者预后明显优于高危组,具有显著的统计学差异,P=0.001;在RFS方面出现同样的结论。提示PENK阳性表达患者与NIH低、中危患者的OS和RFS显著高于高危患者,反之则预后较差。为明确268例GIST患者中一些病例服用伊马替尼对其OS和RFS的影响,我们分别对此进行了Logistic回归分析,发现服用伊马替尼(imatinib mesylate,IM)和未服用IM并未对268例患者的OS和RFS产生影响,P值均大于0.05。5)进一步细胞功能实验验证中,PENK过表达GIST-T1细胞和稳转干扰GIST-T1的细胞功能实验中两者呈现截然相反的结论:在细胞增殖实验中,PENK过表达GIST-T1细胞系的增殖能力显著低于PENK稳转干扰GIST-T1细胞系;在体现细胞迁移、侵袭能力的划痕实验以及Transwell实验中(空穿及胶穿),PENK过表达GIST-T1细胞系的迁移、侵袭能力显著低于PENK稳转干扰GIST-T1细胞系;在细胞周期检测中,PENK过表达或稳转干扰GIST-T1细胞系对细胞周期的影响相对较小,差异无明显统计学意义;在细胞凋亡实验中,PENK过表达细胞系GIST-T1诱导凋亡的能力显著高于PENK稳转干扰GIST-T1细胞系;在体外动物实验中,PENK稳转干扰细胞系GIST-T1的诱导成瘤能力显著高于对照组GIST-T1细胞系。因此,在体内和体外两个层面我们验证了PENK作为抑癌基因的抑制GIST增殖的功能。6)在PENK如何触发其抑癌机制研究中,我们发现PENK基因启动受AP-1基因调控,PENK蛋白对细胞周期无显著作用,但PENK蛋白酶切产物阿片类生长因子(opiod growth factor,OGF)可以通过激活抑癌基因P16从而竞争性抑制Cdk4和Cyclin D的结合使得细胞周期阻滞于G0/G1期,抑制GIST的增殖,同时PENK激活凋亡相关通路从而增加GIST凋亡使得GIST生长抑制。初步GIST-T1伊马替尼耐药细胞株功能实验中我们证实PENK蛋白对耐药细胞株的生长无显著作用,但其酶切产物OGF可显著抑制耐药细胞株的生长,为进一步耐药机制探讨打下基础。【结论】1)PENK在低、中危GIST肿瘤组织中呈高表达,在高危GIST肿瘤组织中呈低表达,PENK表达程度与GIST患者的复发率呈负相关而和患者的生存率呈正相关。2)PENK在体内和体外实验中均显示其抑制GIST的增殖功能。3)PENK通过PENK蛋白酶切产物OGF激活抑癌基因P16从而竞争性抑制Cdk4与Cyclin D的结合使得细胞周期阻滞于G0/G1期,抑制GIST-T1细胞的增殖,同时PENK激活凋亡相关通路从而增加GIST-T1细胞的凋亡使得GIST-T1的生长抑制。4)GIST-T1伊马替尼耐药细胞株功能实验中我们证实PENK蛋白在体外对耐药细胞株的生长无明显促进作用,但PENK蛋白酶切产物OGF能够显著抑制GIST-T1耐药细胞株的生长。