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人参(Panax ginseng C.A.Mey)为五加科多年生草本植物,是名贵的中药材。研究表明,人参在调节人体中枢神经系统、提高免疫力、抗疲劳、抗肿瘤、降血糖等方面都有良好功效,因此被广泛用于药品、保健品、化妆品等各类产品中,具有可观的经济价值和广阔的应用前景。人参主要通过种子繁殖,人参种子具有后熟特性,需要经历长时间的形态后熟和生理后熟。目前人参种子后熟的分子机制尚不清晰。赤霉素和脱落酸是调控种子休眠和萌发的关键激素,在人参种子后熟过程中,种胚需要依次完成形态后熟和生理后熟才能发芽,WRKY转录因子能通过调控靶基因的表达,调节植物生长发育。本研究对人参种子进行自然层积处理,筛选赤霉素和脱落酸代谢关键基因(GA2ox、GA20ox、NCED、CYP707A)、植物胚胎发育相关基因(SERK、BBM、WUS、FUS3、AGL15、LEC1)和WRKY转录因子(WRKY3、WRKY6、WRKY40),利用半定量PCR和荧光定量PCR对以上基因在人参种子后熟过程中的表达水平进行检测。本研究结果如下:(1)对新鲜采集的人参种子进行层积处理,每45天取样一次,根据种胚形态和胚率将人参种子后熟过程划分为六个时期,分别为S1-形态后熟早期;S2-形态后熟中期;S3-形态后熟末期;S4-生理后熟早期;S5-生理后熟中期;S6-生理后熟末期。(2)克隆GA和ABA代谢关键基因(GA2ox、GA20ox、NCED、CYP707A)、植物胚胎发育相关基因(SERK、BBM、WUS、FUS3、AGL15、LEC1)和WRKY转录因子(WRKY3、WRKY6、WRKY40)的核心片段,并分别测序。结果显示引物设计和克隆基因长度合理,产物特异性好。(3)以人参5Sr RNA为内参基因,对目的基因进行半定量PCR,根据电泳结果初步判断目的基因在人参种子后熟过程中的表达量。利用实时荧光定量PCR进一步检测基因的表达情况,并分析结果。在人参种子后熟过程中,GA和ABA代谢关键基因:GA2ox基因表达量不断降低,GA20ox基因表达量不断升高;CYP707A基因表达量先降后升,NCED基因表达量不断下降。植物胚胎发育相关基因:基因表达量都表现升高的趋势,只是升高幅度不同。WRKY转录因子:WRKY3基因表达量不断下降,WRKY6基因表达量不断升高,WRKY40基因表达量不断下降。(4)克隆人参GA2ox基因的CDS序列,将其命名为Pg GA2ox,并提交Gen Bank,获得登陆号为KT692958.1。根据测序结果,Pg GA20ox基因的CDS长度为987bp,编码328个氨基酸,与西洋参GA20ox基因氨基酸序列比对相似性为98.78%。(5)克隆人参GA20ox基因的CDS序列,将其命名为Pg GA20ox,并提交Gen Bank,获得登陆号为KX790244.1。根据测序结果,Pg GA20ox基因的CDS长度为1092bp,编码363个氨基酸,与西洋参GA20ox基因氨基酸序列比对相似性为98.90%。(6)克隆人参WRKY3基因的CDS序列,将其命名为Pg WRKY3,并提交Gen Bank,获得登陆号为KX790243.1。根据测序结果,Pg WRKY3基因的CDS长度为1356bp,编码451个氨基酸,与西洋参WRKY3基因氨基酸序列比对相似性为99.33%。本实验通过分析多个植物激素GA、ABA代谢关键基因,植物胚胎发育相关基因和WRKY转录因子的表达情况,为研究人参种子后熟的分子机理奠定基础。