研究背景脑中风是临床最常见的疾病之一,具有发病率、致残率和病死率高的特点,其中缺血性脑中风占全部脑中风的70%～80%。治疗缺血性脑中风常用的药物有三大类,分别是通过促使血管再通复流的溶栓治疗药物、通过减少细胞损伤,改善脑血流的神经保护剂,以及中草药药物治疗。但是由于许多药物存在着疗效弱、副作用多等问题,寻找高效安全的治疗药物仍然任重道远。近年来人们采用小鼠联体共生模型进行抗衰老和再生的研究,发现在年轻鼠血液中含有可以"返老还童"的生长分化因子11(Growth differentiation factor 11,GDF11):它可以改善因衰老而导致的机能下降例如肌肉萎缩、心力衰竭、反应迟钝、认知能力降低等,为衰老和再生医学的研究带来了新的曙光。GDF11是转化生长因子β(Transforming growth factor beta,TGF-β)家族的成员。研究结果显示血液中GDF11分子的表达随着年纪的增加而降低,向老年小鼠体内连续注入体外重组的GDF11蛋白,使其含量恢复到年轻小鼠体内相同的水平时,可以导致许多因衰老而出现的机能下降有所缓和甚至恢复到原先的水平,与年轻血液的作用基本一致。这些结果说明GDF11对体内多种组织器官因衰老引起的功能下降具有明显的改善作用。然而目前对于GDF11在衰老和再生的作用还存在着争议,因为有研究发现将体外重组的GDF11蛋白注入老年小鼠体内抑制了肌肉的再生,得到了相反的结果。研究报道GDF11可以增强老年小鼠脑内的血液循环,促进室管膜下区(Subventricularzone,SVZ)神经干细胞增殖进而使神经元存活能力增强,说明GDF11对脑内神经再生具有促进的作用。另外有文献证实,GDF11在脑缺血再灌注大鼠的皮层缺血半影区表达量显著升高,猜测GDF11可能参与脑缺血再灌注引起的脑损伤的修复过程。在缺血性脑中风后GDF11对脑缺血引起的损伤到底发挥什么作用?是正调控还是负调控?为了解决这些问题,本课题中我们用线栓法局灶性脑缺血再灌注大鼠模型为研究对象,运用分子细胞生物学和动物行为学测试等方法来研究GDF11对脑缺血损伤的防治作用及机制。研究目的1、GDF11在脑缺血损伤治疗中的作用及机制。2、GDF11在脑缺血损伤预防中的作用及机制。研究方法1、建立线栓法局灶性脑缺血再灌注模型使用栓线堵塞大鼠右侧大脑中动脉造成大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO),2小时缺血之后拔线进行血液再灌注。2、脑立体定位微量注射将大鼠用水合氯醛麻醉之后固定在脑立体定位仪上,充分暴露颅骨,以前囟点为零点,按照脑室坐标进行打孔注射,脑室坐标:前后(AP),-0.9mm;左右(L),±1.5mm;背腹(V),-3.6mm。3、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine,BrdU)注射和免疫组织化学染色大鼠在灌流取脑前2小时进行腹腔注射BrdU,取脑后将脑从前向后切成40微米的薄片进行免疫组化染色。BrdU的一抗使用浓度1:500,GDF11的一抗浓度 1:1000,Caspase-3 的一抗浓度 1:500,Ki67 一抗浓度 1:100,Nestin 一抗浓度1:500。4、实时定量PCR将脑组织取出,提取总RNA后反转录成cDNA,用SYBR Green荧光标记法实时定量PCR技术,检测GDF11和内参β-actin的mRNA表达水平。5、评估脑缺血体积取脑后将脑从前向后切成2毫米的脑片,将切好的脑片放在37℃氯化三苯基四氮唑(Triphenyltetrazolium chloride,TTC)溶液里,避光孵育30分钟后,可观察脑缺血范围大小,最后使用Photoshop软件计算脑缺血面积。实验结果1、脑缺血后大鼠皮层缺血半影区GDF11的表达水平显著上升取成功建立脑缺血再灌注模型的大鼠和假手术大鼠各3只,24h后灌流取脑,用免疫组织化学的方法检测GDF11的表达,发现缺血侧皮层半影区GDF11的表达要显著高于假手术组。另取成功造模的大鼠分别再灌注2h、6h、12h、24h、48h后,取其皮层半影区,提取RNA做实时荧光定量PCR,发现6h后GDF11 mRNA水平显著上升,48h后恢复到正常水平。2、GDF11在脑缺血损伤治疗中的作用2.1缺血后给予GDF11外源重组蛋白促使大鼠脑缺血体积下降建立脑缺血再灌注大鼠模型,缺血2h再灌注24h后,进行侧脑室注射GDF11外源重组蛋白,3天后活体取脑进行TTC染色,发现实验组与对照组相比脑缺血体积显著降低。2.2缺血后给予GDF11外源重组蛋白促使大鼠神经功能改善建立脑缺血再灌注大鼠模型,缺血2h再灌注24h后,进行侧脑室注射GDF11外源重组蛋白,3天后根据Longa及Bederson的5分制法进行评分,结果发现实验组与对照组相比神经功能缺陷评分显著下降。3、GDF11在脑缺血损伤治疗中的作用机制3.1缺血后给予GDF11外源重组蛋白显著降低皮层缺血半影区的细胞凋亡建立脑缺血再灌注大鼠模型,缺血2h再灌注24h后,进行侧脑室注射GDF11外源重组蛋白,3天后灌流取脑进行免疫组织化学染色和TUNEL试剂盒染色,发现实验组中皮层半影区凋亡细胞的数量显著降低。3.2缺血后给予GDF11外源重组蛋白使室管膜下区细胞增殖水平下降对大鼠建立局灶性脑缺血再灌注模型,缺血2h再灌注24h后,进行侧脑室注射GDF11外源重组蛋白,3天后灌流取脑,通过增殖标记物BrdU、Ki67进行免疫组织化学染色发现,大鼠脑内GDF11水平升高后导致室管膜下区BrdU阳性细胞及Ki67阳性细胞数显著降低。3.3缺血后给予GDF11外源重组蛋白对室管膜下区周围血管重构无影响为了观察GDF11外源蛋白对室管膜下区周围血管再生的影响,建立大鼠脑缺血再灌注模型,缺血2h再灌注24h后,进行侧脑室注射GDF11外源重组蛋白,3天后灌流取脑,通过血管再生标记物CD31进行免疫组织化学染色发现,大鼠脑内GDF11水平升高后导致室管膜下区周围CD31阳性细胞数目无显著变化。4、GDF11在脑缺血损伤预防中的作用4.1过表达GDF11预处理可减少大鼠脑缺血体积对大鼠进行侧脑室注射GDF11过表达病毒及阴性对照病毒,病毒表达12天后建立局灶性脑缺血再灌注模型,缺血2h再灌注3天后,活体取脑进行TTC染色,发现实验组中脑缺血体积显著降低。4.2过表达GDF11预处理可降低大鼠神经功能缺陷对大鼠进行侧脑室注射GDF11过表达病毒及阴性对照病毒,病毒表达12天后建立局灶性脑缺血再灌注模型,缺血2h再灌注3天后,根据Longa及Bederson的5分制法进行评分,结果发现实验组中神经功能缺陷评分显著下降。5、过表达GDF11对脑缺血损伤预防的作用机制5.1过表达GDF11预处理显著降低皮层缺血半影区的细胞凋亡对大鼠进行侧脑室注射GDF11过表达病毒及阴性对照病毒,病毒表达12天后建立局灶性脑缺血再灌注模型,缺血2h再灌注3天后,灌流取脑进行免疫组织化学染色和TUNEL试剂盒染色,发现实验组与对照组相比,皮层缺血半影区的凋亡细胞受到了保护。5.2过表达GDF11预处理可促使脑缺血再灌注模型大鼠SVZ脑区细胞增殖向大鼠侧脑室微量注射GDF11过表达慢病毒,病毒表达12天之后建立局灶性脑缺血再灌注模型,缺血2小时再灌注3天后对大鼠进行腹腔注射BrdU,2小时后进行灌流取脑和免疫组织化学染色,结果发现GDF11使得MCAO大鼠SVZ脑区增殖标记物BrdU阳性细胞数显著上升。5.3过表达GDF11预处理促进脑缺血再灌注模型大鼠SVZ脑区周围血管再生对大鼠进行侧脑室注射GDF11过表达病毒及阴性对照病毒,病毒表达12天后建立局灶性脑缺血再灌注模型,缺血2h再灌注3天后,灌流取脑通过血管再生标记物CD31进行免疫组化染色发现,大鼠脑内GDF11过表达后导致室管膜下区周围CD31阳性细胞数显著增加。6、GDF11通过调控Smad2/3信号通路参与脑缺血损伤的治疗及预防作用为了阐明GDF11参与脑缺血防治的分子机制,我们取分别注射了 GDF11外源重组蛋白及注射了 PBS的大鼠进行脑缺血再灌注模型的建立,缺血2h再灌注3天后对大鼠缺血半影区进行取材,通过Western blot检测发现GDF11外源蛋白的处理使得pSmad2/3 水平显著升高。同样,我们对大鼠注射GDF11过表达病毒及阴性对照病毒12天后建立脑缺血再灌注模型,缺血2h再灌注3天后对大鼠缺血半影区进行取材,通过Western blot检测,发现过表达GDF11预处理使得pSmad2/3水平显著升高。总之,GDF11通过调控Smad2/3信号通路参与脑缺血的预防和治疗。实验结论1、脑缺血再灌注后,GDF11在皮层缺血半影区表达上调。2、GDF11可以参与治疗脑缺血再灌注所致的神经损伤,通过抑制半影区细胞凋亡的作用机制。3、GDF11在脑缺血再灌注预防中发挥作用,可通过促进SVZ脑区细胞增殖,增强周围血管的再生以及抑制半影区细胞凋亡方式,减少脑缺血再灌注造成的损伤。4、GDF11在脑缺血防治中的作用是通过调控Smad2/3信号通路实现的。创新点1、GDF11对大鼠脑缺血再灌注所致的损伤具有预防和治疗作用。2、GDF11在预防和治疗大鼠脑缺血再灌注损伤方面的作用机制不同。