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大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的一种病毒,能侵染大豆并引起花叶、皱缩和坏死等症状,在全球大豆产区造成了严重的减产和品质下降。以传统育种方式培育抗SMV新品种是当前最普遍的防治策略,但这种方法培育出的品系对SMV不同株系的抗性存在差异。同时病毒的遗传物质简单,往往易变异分化出不同的株系。因此传统育种方法在病毒防治方面有很大的局限性。当下发展迅速的转基因技术和RNA干扰技术能打破这一屏障,培育出对大豆花叶病毒具有广谱抗性的新品种。在酵母双杂实验(Yeast Two Hybrid,Y2H)中发现大豆翻译延伸因子1A(Soybean Translation Elongation Factor,GmEF1 A)和大豆液泡三磷酸酶(Soybean Vacuolar-ATPase,GmVATP)与SMV-P3有很强的互作关系,也与病毒复制相关。随后的病毒诱导的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing,VIGS)实验发现,GmEF1A和Gm VA TP功能的阻断或干扰能抑制SMV对大豆的侵染。但未见利用农杆菌介导的大豆子叶节转化法将GmEF1A基因和Gm VA TP基因的干扰片段进行大豆遗传转化,以验证其在大豆花叶病毒侵染的时作用的报道。因此,本研究利用Gateway技术构建干扰表达载体并进行大豆遗传转化,对筛选出的阳性苗进行加代繁殖和抗性鉴定,分析GmEF1A基因和Gm VA TP基因的功能,并为高世代筛选提供可用的种质资源。对大豆GmEF1A全部5个拷贝和Gm VATP全部2个拷贝的核苷酸和氨基酸序列进行比对,确定其功能保守区域,应用 Gateway技术构建RNAi载体pB7GWIWG2(Ⅱ)-EF1Ai和pB7GWIWG2(Ⅱ)-VA TPi。利用农杆菌介导的大豆子叶节转化方法,以天隆1号为受体材料,bar基因为筛选标记进行大豆转基因实验。共计获得GmEF1A转基因抗性组培苗8株,Gm VATP转基因抗性组培苗37株。通过除草剂涂抹、PCR和PAT/bar转基因检测试纸鉴定,共筛选出GmEF1A转基因阳性T0代转基因大豆植株7棵,Gm VA TP转基因T0代转基因大豆植株33棵,平均转化率为2.75%。这不仅为验证该基因在大豆花叶病毒侵染过程中发挥的功能提供实验材料,也为研究抗病反应有关通路和明确候选基因在该通路中的作用提供新途径。已收获的40株T0代转基因阳性植株在隔离网室进行加代繁殖,共计获得19株GmEF1A T1代转基因阳性植株和160株Gm VATPT1代转基因阳性植株。Southern blot杂交和绝对荧光定量拷贝数分析确定外源基因以低拷贝的方式插入到大豆基因组。T1代分离比卡方(χ2)分析发现有符合3:1或15:1分离比的T0家系。抗病鉴定共筛选出T1代Gm VATP转基因高抗大豆41棵,GmEF1A转基因高抗大豆11棵。T1代GMV4TP和GmEF1A转基因大豆花期倒三叶的平均发病等级分别为1.12和1.08,远低于非转基因植株发病等级3.07。对T2代转基因大豆植株qRT-PCR和DAS-ELISA分析发现,Gm VA TP基因和GmEF1A基因的表达都受到了抑制。转基因植株中大豆花叶病毒的含量都显著低于非转基因植株,且含量随着时间推移而下降。接种SMV 15天和30天后,采样的转基因植株体内SMV含量均为阴性。对T2代转基因植株进行抗病性鉴定,共获得20株GmEF1A和23株Gm VA TP高抗转基因植株。种皮褐斑率调查结果显示,GmEF1A和Gm VA TP转基因植株种皮平均褐斑率分别为2.09%和2.82%,远低于阴性对照的87.39%。