论文部分内容阅读
茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)属山茶科山茶属,是多年生常绿叶用经济作物,富含大量具有经济价值和药用价值的次级代谢产物。紫色芽叶茶树是一种特色的茶树种质资源,茶树幼嫩芽叶的紫化现象以及特异性的紫色茶树品种被认为与花青素在叶片中的累积有关。本研究首先从生理生化水平、转录水平、蛋白水平比较分析了茶树同一时期不同发育程度紫化色嫩叶与成熟绿色叶片的差异。最后,应用Gateway技术体系构建了调控茶树花青素合成途径的转录因子的CsMYB75过表达载体,并成功将其转入根癌农杆菌GV3101,通过烟草瞬时表达对其功能进行初步鉴定,从而为阐释茶树体内花青素的生物合成机理提供依据。(1)不同发育时期的茶树叶片生化成分含量差异很大:紫色幼嫩新梢中茶多酚、儿茶素总量、咖啡碱含量高于成熟绿色叶片,差异达到极显著;光合色素中,成熟绿叶样品中叶绿素及叶绿素a、b的含量、类胡萝卜素的含量极显著高于幼嫩紫叶样品,花青素含量极显著低于幼嫩紫叶。(2)应用cDNA-AFLP银染技术,分析紫色幼嫩新梢和成熟叶片的差异基因。应用256对引物组合进行扩增,最终得到148差异条带,其中上调表达77条,下调表达71条。GO注释功能分析将其分为11个类别。(3)建立了茶树叶片比较蛋白质组学研究的实验技术体系,应用双向电泳技术和蛋白质谱技术,研究了茶树生长发育期间蛋白质表达谱的变化。通过比较幼嫩紫叶和成熟绿叶的蛋白表达谱,共检测到大约900个蛋白点,统计分析后得到48个具有显著差异的蛋白点,经MALDI-TOF分析,成功鉴定出46个蛋白(26个上调表达,20个下调表达),并将其按功能分为7类,碳水化合物和能量代谢相关蛋白所占比例最大(50%)。通过又从中选取7个蛋白进行荧光定量PCR验证,发现这些蛋白质在mRNA水平的表达与在蛋白水平的表达是一致的。(4)克隆了三个与花青素合成相关的全长基因。嫩紫叶时期上调表达的黄酮类3’单氧酶(Flavonoid 3’-monooxygenase,TDF#33411f)、UDP-糖基转移酶(UDP-glycosyltransferase,TDF#2421<sub>1d)、类黄酮糖基转移酶(UDP glucose:flavonoid 3-O-glucosyltransferase,TDF#44111fb)等基因片段,通过SMART-RACE技术获得这些基因全长,并对其序列进行生物信息学分析。(5)筛选出一条MYB基因,与拟南芥中调控花青素生物合成的R2R3MYB相似度较高,命名为CsMYB75,并克隆其ORF区。(6)借助Gateway cloning system构建了茶树CsMYB75基因的过表达载体,并将其成功转入根癌农杆菌GV3101中。(7)通过烟草瞬时表达,初步研究了花青素合成途径中CsMYB75基因的功能,并成功看到表型变化,为后期培育高花青素含量的茶树种质资源提供了基础。