目的:原核表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)过氧化物氧化还原酶(peroxiredoxin,Prx)的基因,并制备多克隆抗体。使弓形虫Prx基因在Hep G2细胞过表达,不同终浓度H2O2诱导细胞凋亡,通过测定细胞的ROS生成量的变化来探讨Prx在细胞抗氧化中所起的作用以及作用机制。方法:构建原核表达载体Prx/p ET-28a(+)使之在大肠埃希氏菌(E.coil)Rosetta株中表达,通过对重组蛋白诱导表达时间、浓度和温度的优化及纯化,用纯化后的重组蛋白免疫家兔得到多克隆抗体,用Wesstern blotting的方法鉴定多克隆抗体的特异性。构建真核表达载体Prx/p3XFLAG-Myc-CMVTM-24使之在Hep G2细胞中表达,通过大量提取无内毒素质粒,利用非脂质阳离子聚合物Ronfect TM试剂将质粒转染至Hep G2细胞中,在24 h、48 h和72 h收集转染的细胞,用抗Prx多克隆抗体通过Wenstern blotting的方法检测Prx基因在Hep G2细胞的表达。24孔板接种培养Hep G2细胞24 h后,分别转染空载p3XFLAG-Myc-CMVTM-24质粒(空载转染组)和真核表达重组质粒Prx/p3XFLAG-Myc-CMVTM-24(转染组),收集细胞前24 h加入终浓度为200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L和1 600μmol/L的H2O2诱导细胞凋亡。于转染后48 h收集细胞,对细胞悬液用Annexin V-FITC/PI染色,利用流式细胞术检测细胞凋亡率。用DCFH-DA染色,利用流式细胞术检测细胞活性氧的生成量。结果:原核表达获取的多克隆抗体经过Wenstern blotting方法鉴定证明有很好的特异性,可用于后续试验。转染后24 h、48 h和72 h的Hep G2细胞,用Wenstern blotting方法在25 KDa处检测到有特异性行条带出现,与Prx理论大小相符,且Prx在48 h表达量最高。转染后48 h,H2O2终浓度为200μmol/L、400μmol/L和800μmol/L转染组的凋亡率均低于转染空载组的凋亡率,两组差别有统计学意义(P<0.05),终浓度为1 600μmol/L的转染组的凋亡率和转染空载组的凋亡率无明显差别。转染后48 h,H2O2终浓度为200μmol/L、400μmol/L和800μmol/L的转染组的ROS的生成量低于空载组ROS的生成量,两组差别有统计学意义(P<0.05),终浓度为1 600μmol/L的转染组的ROS生成量和空载组的ROS生成量无明显差别。结论:成功构建原核表达载体Prx/p ET-28a(+)并在Rosetta中大量表达,得到纯化后的重组蛋白,免疫家兔获得多克隆抗体,Wenstern blotting技术鉴定多克隆抗体有很好的特异性。成功构建真核表达载体,Prx蛋白在Hep G2细胞过表达,且转染后48 h表达量最高。弓形虫Prx具有抗氧化作用,其作用机制是,通过消除细胞内的ROS,从而减少氧化应激对虫体的损害,达到抗氧化的目的。