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目的:探讨顺铂(cisplatin,CDDP)对人乳腺癌细胞自噬水平的影响,明确抑制自噬在顺铂调控人乳腺癌细胞凋亡中的作用及初步分子机制。方法:1.不同浓度顺铂处理人乳腺癌细胞MCF-7及MDA-MB-231后,CCK-8(Cell counting kit 8)实验检测顺铂对MCF-7和MDA-MB-231细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50);蛋白质印迹法(western blotting,WB)检测LC3、p62、Cleaved-caspase3以及Cleaved-PARP的表达情况;Hochest染色法观察核形态变化;免疫荧光检测LC3颗粒的形成;透射电子显微镜观察MCF-7细胞的细胞质空泡、线粒体肿胀、染色质聚集、凋亡小体以及自噬小体的形成。2.不同浓度顺铂处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231后,western blotting检测MAPK信号通路中的相关分子;其中一组分别加入ERK抑制剂PD98059、p38抑制剂PD169316或JNK抑制剂SP600126,采用western blotting检测LC3表达情况。3.不同浓度顺铂处理人乳腺癌细胞MCF-7及MDA-MB-231后,western blotting观察p-YAP水平,并进一步分离核浆蛋白观察YAP的核浆分布情况。其中一组同时加入自噬抑制剂羟化氯葵(Hydroxychloroquine,HCQ),采用western blotting检测LC3、p-YAP、YAP、CTGF以及Cleaved-caspase3的蛋白表达情况,并采用流式细胞分析检测细胞的凋亡比例。4.构建YAP的shRNA慢病毒,感染乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231,嘌呤霉素(Puromycin)筛选YAP稳定干扰细胞株,western blotting验证其干扰效果;用不同浓度顺铂处理细胞,CCK-8实验检测IC50的变化,并同时采用western blotting检测凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3的表达。结果:1.CCK-8实验结果表明,2,4,6,8,10μg/ml顺铂均能够明显抑制人乳腺癌细胞的增殖能力,且MCF-7和MDA-MB-231细胞的IC50分别为6μg/ml和8μg/ml;western blotting结果显示,随着顺铂浓度的增加,凋亡相关标志物Cleaved-PARP、Cleaved-caspase3和自噬相关标志物LC3蛋白水平逐渐增加,p62逐渐降低;Hochest染色显示细胞的染色质浓缩、聚集;免疫荧光观察到LC3颗粒的增多;透射电子显微镜观察到,顺铂处理组MCF-7细胞内空泡、线粒体肿胀、染色质聚集、凋亡小体以及自噬小体形成。2.Western blotting结果显示,顺铂激活MDA-MB-231中ERK、p38、JNK三条信号通路;阻断ERK信号通路后,顺铂诱导LC3的蛋白表达作用被抑制,而阻断p38和JNK信号通路则对顺铂上调LC3蛋白表达作用无影响。3.Western blotting实验显示,随着顺铂浓度的增加,p-YAP减少,同时YAP在细胞核中聚集增多;western blotting和流式结果表明,与顺铂单独处理相比,顺铂和羟化氯葵同时作用能降低LC3和CTGF表达,以及促进细胞凋亡和p-YAP增加。4.CCK-8实验结果表明,当干扰YAP后,乳腺癌细胞对顺铂的敏感性增加;western blotting结果显示,YAP的缺失明显增强顺铂引起的细胞凋亡,Cleaved-caspase3表达增加。结论:1.顺铂促进人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231凋亡,并且诱导自噬的发生。2.顺铂通过激活MAPK/ERK信号通路诱导人乳腺癌细胞自噬。3.顺铂诱导人乳腺癌细胞自噬,从而调节YAP入核。4.干扰YAP加强人乳腺癌细胞对顺铂的敏感性。5.抑制自噬增强顺铂诱导人乳腺癌细胞的凋亡。