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背景:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性的认知障碍、记忆力减退和性格行为改变等症状为主的影响老年人的中枢神经系统退行性疾病。AD由于严重影响患者的生活能力,重症患者甚至日常生活不能自理,给患者家庭和整个社会带来沉重的经济和社会负担。AD的典型特征是在脑中沉积的β-淀粉样蛋白(β-Amyloid peptide,Aβ),Aβ是通过淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的蛋白裂解产生。众多证据表明线粒体的功能异常对AD的发病起到了关键作用。体内和体外研究支持线粒体在APP代谢和细胞转运中起的重要作用。近年来,作为线粒体转录终止因子家族成员之一的线粒体转录终止因子4(mitochondrial transcription termination factor 4,MTERF4)被发现具有调节线粒体DNA转录和直接控制线粒体核糖体翻译的功能。MTERF4可能通过对线粒体功能的调节因而和AD的发病相关。目的:本研究观察MTERF4在APP/PS1双转基因小鼠海马组织中的表达情况,进一步研究MTERF4过表达与敲低在体外对APP代谢途径的影响与机制,揭示MTERF4在AD发病机制中的作用。方法:利用Western blot技术检测MTERF4在6月龄APP/PS1转基因小鼠中及同月龄野生对照小鼠海马组织中的表达情况。用分子克隆技术,构建pc DNA-MTERF4真核表达载体和p GPH1/GFP/Neo-MTERF4干扰载体。培养HEK293-APPswe细胞,分别将构建的过表达载体和RNA干扰载体转染细胞,采用Western blot技术检测细胞中MTERF4、APP、C99、C83、ADAM10和BACE1的蛋白表达水平。用Trizol法提取细胞的总RNA,反转录合成c DNA后进行实时荧光定量PCR检测,观察MTERF4、APP、ADAM10和BACE1基因在转录水平上的表达。构建含有ADAM10启动子序列的荧光素酶报告基因质粒p GL3-ADAM10,将pc DNA-MTERF4与p GL3-ADAM10共转染到HEK293细胞中,用海肾荧光素酶活性作为内参,通过对重组质粒表达荧光素酶活性的分析,确定过表达MTERF4对ADAM10基因启动子活性的影响。应用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)来检测分泌到细胞外的Aβ42的生成量。采用流式细胞技术检测MTERF4过表达与敲低时的细胞周期情况。CCK-8法检测MTERF4过表达与敲低对HEK293-APPswe细胞增殖的影响。结果:Western blot结果显示在APP/PS1双转基因小鼠的海马组织中MTERF4蛋白表达水平增加68%。成功构建针对MTERF4基因的pc DNA-MTERF4过表达载体和p GPH1/GFP/Neo-MTERF4干扰载体。与对照组相比,将重组质粒pc DNA-MTERF4瞬时转染到HEK293-APPswe细胞24和48小时,MTERF4蛋白水平分别显著增加了67%和258%。实时定量PCR结果显示,pc DNA-MTERF4转染的细胞中MTERF4 m RNA水平在24和48小时增加235和216倍。MTERF4的过表达诱导了HEK293-APPswe细胞中APP蛋白和胞外分泌的Aβ42水平的显著增加。另外,APP蛋白切割加工产生的C99水平升高37%、C83水平降低27%,表明MTERF4过表达抑制了APP蛋白的α-切割而促进了β切割。实时荧光定量PCR结果显示,MTERF4过表达组细胞中的ADAM10 m RNA水平在转染48小时后降低68%。Western blot检测显示MTERF4的过表达抑制ADAM10的蛋白表达(下降27%)。双荧光素酶报告基因检测结果显示过表达MTERF4蛋白可抑制ADAM10基因启动子区域的启动子活性。MTERF4过表达不影响HEK293-APPswe细胞的周期分布和细胞增殖。在HEK293-APPswe细胞中利用p GPH1/GFP/Neo-MTERF4质粒干扰MTERF4基因的表达。将重组质粒转染到HEK293-APPswe细胞24和48小时,MTERF4蛋白水平分别降低了9%和36%。定量实时PCR结果显示,MTERF4敲低的细胞中MTERF4 m RNA水平在24和48小时降低19%和66%。与对照组相比,敲低MTERF4 48小时后细胞中APP蛋白表达水平降低26%,胞外Aβ42水平降低24%。同时APP代谢产物C99和C83水平分别降低19%和32%。干扰质粒转染细胞48h后,细胞中ADAM10蛋白水平降低了26%,而在24小时细胞中ADAM10蛋白水平无明显变化。与对照组相比,在MTERF4敲低24和48小时后,细胞中ADAM10 m RNA表达分别降低21%和51%。敲低MTERF4 24和48小时,细胞周期在G0/G1期的细胞百分比减少、S期细胞百分比增加,G2/M期细胞百分比无明显差异。干扰质粒转染细胞48h后,与对照组相比较细胞增殖降低11%。结论:MTERF4蛋白表达在APP/PS1转基因小鼠海马组织中上调。在体外该基因过表达增加了HEK293-APPswe细胞中APP蛋白水平并通过抑制α-分泌酶ADAM10促进APP的淀粉样蛋白形成加工。敲低MTERF4表达则通过抑制细胞中APP表达降低淀粉样蛋白形成加工,并对APP和ADAM10基因在转录和翻译水平都具有下调作用。另外,敲低MTERF4表达对细胞周期和细胞增殖具有一定的影响。这些结果表明MTERF4对引发AD的APP表达及代谢通路具有调控作用,两者呈正相关关系。MTERF4可能在AD的发病机制中发挥重要作用,该机制为探索AD的治疗方法提供了新思路。