盐霉素(salinomycin)属于典型的聚醚类抗生素,由白色链霉菌(Streptomyces albus)合成,在农业上主要用于治疗鸡球虫病,在医药上具有抗肿瘤细胞活性,是一种潜在的抗肿瘤药物。本论文主要开展了白色链霉菌诱变育种筛选技术研究和双组份系统RspA1/A2对白色链霉菌基础代谢及盐霉素合成等次级代谢全局调控研究。首先,以工业白色链霉菌(S.albus)S12为出发菌,建立菌种高效诱变筛选平台,通过高通量筛选获得高产菌,同时在转录组数据基础上分析诱变育种提高盐霉素生物合成能力的可能作用机制;其次,研究白色链霉菌(S.albus)双组份系统RspA1/A2对细胞生长相关的初级代谢(如葡萄糖中心代谢途径、氮源代谢和磷源摄入等途径)和盐霉素生物合成等次级代谢的全局调控机理,理解细胞生长和盐霉素合成等次级代谢之间关系。具体结果如下:1.盐霉素工业菌菌种诱变及高产菌株高效合成盐霉素机理研究本研究在已建立的菌种诱变筛选方法基础上,采用琼脂糖扩散法替代原来的24孔板发酵方法来表征盐霉素效价,最后使筛选周期缩短了 18天,筛选效率明显提高。在高产菌株筛选方面,采用常温等离子(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变工业菌株S12生成菌种突变库,并通过复合抗性筛选正突变菌株,最后得到了一株能稳定遗传的盐霉素高产菌株TC和一株负突变(阴性)菌株TK。与出发菌S12相比,高产菌株TC细胞干重和盐霉素效价最高分别是13.35g/L和33171ug/mL,分别提高了 20%和112%。对三株菌株S12、TC以及TK转录组测序,通过比较转录组数据发现:(1)TK、TC和S12有1603个共差异基因,这些基因涵盖了白色链霉菌大部分的代谢途径,包括初级代谢中的糖酵解途径,TCA循环以及次级代谢中的抗生素合成等。(2)丁醇代谢、淀粉和蔗糖代谢及乙醛酸循环与盐霉素合成密切相关,盐霉素产量越高,这些代谢途径的基因越活跃。(3)基于比较盐霉素高产突变菌TC和出发菌A30转录组数据差异,提出了 ARTP诱变和抗性筛选提高盐霉素合成能力可能机理。即:APTP诱变和抗性筛选产生的压力信号通过细胞膜传导到胞内引起核糖体蛋白L28、L31、L33、S12等基因突变,致使(p)ppGpp的积累,激活严谨反应。其次,核糖体蛋白突变和严谨反应进一步刺激转录调控因子GlnR、RspA1/A2和Sigma因子(SigB、SigE、SigW)等调控因子的激活。然后,这些调控因子调控白色链霉菌全局代谢,包括盐霉素前体的合成、盐霉素合成密切相关代谢途径基因的激活以及盐霉素合成基因簇中基因转录水平的提高。通过这一系列的级联信号协调作用,从而提高了 TC突变菌的盐霉素合成能力。2.双组份系统RspA1/A2调控盐霉素生物合成通过基因组分析和蛋白序列对比,在S.albus DSM41398基因组中发现一个与天蓝色链霉菌AsfQ1/Q2高度同源的双组份系统,为此命名为双组份系统RspA1/A2。为了研究RspA1/A2对盐霉素的调控功能,在工业白色链霉菌A30基础上成功构建基因rspA1缺失菌ArspA1和回补菌△rspA1a。发酵结果表明响应蛋白RspA1正调控盐霉素的生物合成,进一步发现,响应蛋白RspA1能够从两个方面影响白色链霉菌盐霉素合成:一方面,响应蛋白RspA1能够特异性地结合盐霉素合成基因簇中编码途径专一调控因子SlnR基因启动子区域,正调控它的转录水平,从而促进盐霉素的合成;另外一方面,基因sigW编码一个类似SigW因子,RT-qPCR和发酵结果发现SigW负调控基因slnR的转录,抑制盐霉素的合成,同时促进白色链霉素菌生长。磷酸化的响应蛋白RspA1能够结合下游基因sigW启动子区域,促进sigW的转录,间接影响盐霉素的合成。3.双组份系统RspA1/A2调控白色链霉菌初级代谢机制研究发酵数据显示,缺失菌△rspA1相对出发菌A30在含75mM谷氨酸发酵培养基中培养时,葡萄糖消耗速率更低且生物量积累更少,说明双组份系统RspA1/A2响应蛋白RspA1在特定条件下能够促进葡萄糖的分解代谢并促进细胞生长。进一步研究发现双组份系统RspA1/A2在碳源、氮源以及磷源代谢三个方面发挥调控作用,从而影响白色链霉菌葡萄糖代谢和细胞生长。在碳源代谢方面,蛋白RspA1通过直接调控gap、pdh和cit这些基因的转录水平,增强了以糖酵解和TCA循环为主的丙酮酸驱动的葡萄糖分解代谢途径的通量。同时,出发菌A30以丙酮酸和谷氨酸为底物的糖异生途径被显著减弱了,转录组数据分析发现糖异生途径中的三个关键基因(pyc、pck和glpX)和谷氨酸通过TCA循环转化为草酰乙酸途径中的基因(sdh,gdhA,sucA,fum)转录水平显著下调。在氮源代谢方面,双组份系统RspA1/A2增强了编码谷氨酸转运蛋白基因gluA-D的转录水平,促进出发菌A30对谷氨酸的摄入。同时,谷氨酸进入尿素循环途径中的arg基因转录水平显著上调,促进摄入的谷氨酸进入尿素循环分解。在磷源代谢方面,pstS和pstA、pstB、pstC共同编码ABC转运蛋白,形成蛋白复合体负责磷酸源的转运,结果表明响应蛋白RspA1能够直接结合基因pstS启动子区域并促进它的转录水平。总而言之,双组份系统RspA1/A2促进谷氨酸和磷酸源的摄入以及谷氨酸进入尿素循环,这种对碳源、氮源以及磷酸源的全局调控能够维持C/N/P代谢平衡,更好的促进细胞生长,促使出发菌A30生物量积累比rspA1缺失菌ArspA1更高。