前列腺癌是在体内外各种因素的作用下,由一系列基因连续突变导致细胞生长失去控制所致。相同病理类型的前列腺癌可能是不同的分子疾病,即使是同一种组织学类型的肿瘤,其突变的基因以及肿瘤相关的细胞信号通路、肿瘤的生物学行为也存在很大的差异,这种复杂的异质性尚无法准确预测,也解释了为什么一部分患者开始即对抗雄药物治疗有效而部分无效,其可能机制之一为前列腺癌细胞内同时存在激素依赖和激素非依赖克隆。目前对于激素非依赖性前列腺癌或称去势抵抗性前列腺癌(CRPC)缺乏早期诊断的方法,尚无公认的标志物,如何在病理诊断时能初步筛选出可能存在的亚型,早期发现CRPC相关的标志物,对于指导前列腺癌的个体化治疗有重要意义。本研究整合基因组学和蛋白组学的方法,初步探讨CRPC有关的蛋白分型方法,开发早期诊断方法和疗效判断体系,探讨潜在的治疗靶点。目的:制备可同时检测7种人前列腺癌组织内蛋白的Elisa试剂盒,初步筛选与CRPC相关的指标以早期诊断CRPC,对前列腺癌内可能存在的不同亚型及潜在治疗靶点进行检测,为实现CRPC的早期诊断和前列腺癌个体化治疗提供参考依据。方法:本研究分主要分3部分:一、采用Affymetrix表达谱芯片检测雄激素依赖性与雄激素非依赖性原位前列腺癌裸鼠模型(本实验室前期建立),筛选出两种类型前列腺癌的差异表达基因。采用聚类分析方法分别对基因表达谱进行相关性分析,利用分子功能注释系统(Molecule Annotation System,MAS)进行数据分析。对ADPC和CRPC组织采用SILAC磷酸化蛋白组学高通量检测和生物信息学分析,通过蛋白功能研究,初步确定了Hippo-Yapl-mTOR及Raf/PAK2/Erk两条信号通路中的多个激酶在激素非依赖转化中起到重要的作用。通过基因芯片与蛋白组学结果的比对和蛋白功能研究,筛选出CRPC高表达和有潜在治疗价值的蛋白。进一步选取BPH、ADPC与CRPC组织进行验证,通过比较基因芯片和蛋白组学筛查结果,参考文献报道及查阅前列腺癌蛋白数据库,初步确定有助于CRPC早期诊断和指导个体化治疗的蛋白作为检测指标。二、抗体芯片技术的关键是如何制备及筛选具有高特异性、高亲和力的配对抗体。首先要利用GeneBank数据库查出7种蛋白相应的编码基因序列,用NCBI提供的BLAST系统分析确定其特异性序列,采用基因重组的方法行7种蛋白的基因全长表达,以表达后的纯化蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠,5次免疫后检测抗体达到效价要求之后取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞系进行杂交瘤的融合,筛选获得阳性的单克隆细胞株,挑选一只最佳克隆采用小鼠腹腔接种法大量制备单抗。多抗制备是以7种重组蛋白为抗原免疫兔,共免疫5次,取血Elisa测定抗体效价,达到要求后纯化抗体备用。三、利用7种单抗制备的间接Elisa检测方法对20例人前列腺组织样本(5例BPH,10例ADPC,5例CRPC)进行7种蛋白进行检测,同时选取其中的一种蛋白(FKBP5)进行双抗夹心法定量检测,以验证自制抗体的灵敏度及特异性,同时为下一步开发定量检测的抗体芯片进行实验条件的初步探索和进行抗原抗体反应条件的优化,探讨联合检测7种目标蛋白方法的可行性,初步筛选有助于CRPC诊断的指标,探讨其在指导个体化治疗临床应用价值。结果:1.Affymetrix表达谱芯片共筛查出差异明显的基因651个,其中上调基因475个,下调基因176个,蛋白组学高通量检测发现ADPC与CRPC差异磷酸化蛋白200余个,通过基因芯片与蛋白组学结果的比对,并根据我们的前期研究和参考文献及前列腺癌蛋白组学数据库,我们筛选出了乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)、FKBP5蛋白、PIM-1蛋白激酶、神经降压素(NT、)环氧合酶-2(C0X-2或者PTGS2)、酪氨酸蛋白激酶(Lyn)、苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)等7个蛋白作为激素非依赖性前列腺癌筛选指标和潜在治疗靶标蛋白进行研究。2.利用基因工程方法成功的重组表达7个蛋白,其中全长表达3个,部分表达4个。利用重组的7种蛋白免疫动物,共获得高特异性和高效价的7对抗体,Elisa检测抗体效价均>1:20000,WB以及IHC验证具有较高的特异性和敏感性,可用于Elisa检测和抗体芯片的开发。3.多次实验优化条件后,初步开发出多指标检测的间接ELisa方法,同时选取FKBP5进行双抗夹心法定量检测以初步确定前列腺癌组织中蛋白的具体浓度。初步检测结果显示Elisa与IHC染色有具有较高的符合率(85.7%),FKBP5定量检测初步确定了前列腺癌中FKBP5蛋白的浓度,为下一步开发能精确定量的抗体芯片提供了初步实验数据。结论:1.自行制备的7个蛋白的抗体可用于前列腺癌分子分型的Elisa诊断试剂盒及抗体芯片的开发,间接Elisa能够检测出ADPC与CRPC的差异蛋白,为建立CRPC早期诊断模型和指导前列腺癌个体化治疗提供了一种新的技术平台,为下一步开发多指标定量检测抗体芯片打下了基础。2.初步结果显示FKBP5,AKT,NT,PIM-1可作为CRPC初步筛查指标,多指标联合检测可提高检测的敏感性。7个蛋白参与不同信号通路,在前列腺癌中表达均明显高于良性前列腺增生,可作为前列腺癌个体化治疗的潜在靶点,对其进行检测将有助于个体化治疗药物的选择。