肺癌死亡率居各类恶性肿瘤之首，是对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一。世界卫生组织预测，到2025年中国每年将有超过一百万新发肺癌病例。早发现早治疗对延长恶性肿瘤患者生存期有积极作用，研究有效的肺癌早期诊断方法和技术对肺癌的防控有重要意义。血清中肿瘤标志物的存在或量变可以提示肿瘤性质的变化，用以辅助肿瘤诊断、分类、预后判断及治疗指导，具有高效、灵敏、创伤小、标本易获取等优点，是肿瘤早期诊断的重要指标。目前，临床用于检测的肺癌标志物均为肿瘤相关标志物，且单一肿瘤标志物往往局限临床诊断，多肿瘤标志物联合检测可显著提高诊断灵敏度、特异度和准确度。通过肿瘤标志物蛋白芯片对肺癌患者及健康体检者血清中的肿瘤标志物水平做相关回顾性分析，发现糖类抗原19-9(carbohydrate antigen19-9，CA19-9)，癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)，糖类抗原125(carbohydrate antigen125，CA125)，糖类抗原15-3(carbohydrate antigen15-3，CA15-3)，神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)等肿瘤标志物与肺癌呈较高的相关性。其中，CA19-9、CA15-3、CEA、CA125等4种标志物的联合检测可显著增加肺癌诊断的特异度和准确度。因此，发展四种标志物联合检测的高灵敏免疫传感技术，有望辅助提高肺癌早期诊断率，对肺癌的防控及疗效评估有重要的临床价值。电致化学发光(ECL)是将电化学与化学发光相结合，通过电化学反应产生氧化还原激发态，激发态物质自身或与体系其他共存物质之间反应而产生的化学发光现象。电致化学发光量程宽，不同发光探针激发电位间隔宽，不互相干扰，可在同一单电极界面上对多种发光信号同时检测。将免疫分析技术与电致化学发光或电化学传感技术相结合，构建电致化学发光或电化学免疫传感器，有望实现快速、便携的多标志物联合检测，对提高肺癌早期诊断率有着至关重要的意义。纳米材料具有特殊的物理化学性能及生物兼容性，既可用于固定或标记抗体，也可增强导电性和催化光量子反应从而增强ECL和电化学信号，广泛地应用在ECL和电化学免疫分析领域。生物酶可通过与底物的反应，催化放大检测信号提高检测灵敏度，其在电化学免疫分析中应用较广，但在ECL免疫分析中应用较少。将纳米材料与生物酶结合，通过协同催化作用，能呈现出几何倍数级的催化反应效率，以此构建免疫传感器，能明显放大检测信号，提高检测灵敏度，有利于恶性肿瘤产生初期低浓度水平肿瘤标志物的高灵敏检出，有助于肺癌等恶性肿瘤的早发现、早诊断。本研究首先通过统计分析C-12蛋白芯片对1848例肺癌及非肿瘤患者肿瘤标志物的检测结果，并结合临床资料进行回顾性研究，找出与肺癌呈显著相关性的4项肿瘤标志物，分析其联合检测的特异度、灵敏度和准确度。然后，以这4种肿瘤标志物为免疫检测标志物模型，将纳米技术、酶免疫技术、电致化学发光、电化学分析技术相结合用于构建电致化学发光和电化学免疫传感器，并初步探索用于肿瘤标志物联合检测的免疫传感分析。实验分别基于NADH酶交联纳米银的纳米复合物催化放大联吡啶钌ECL信号，HRP酶与底物H2O2的催化反应放大K2S2O8的ECL信号，采用夹心法和直接法两种免疫模式，构建针对CA125和CEA超灵敏检测的电致化学发光免疫传感器。同时，以具有一定电位间隔的电化学探针分别掺杂纳米TiO2，标记anti-CA19-9和anti-CA15-3两种抗体，采用夹心免疫识别模式，构建双组分联合同时检测的电化学免疫传感器。研究目的1．肺癌相关性肿瘤标志物在不同病理类型肺癌中的表达及其临床意义，筛选出与肺癌相关性较高，且适用于肺癌早期诊断的联合检测用肿瘤标志物。2．利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶(NADH)和银纳米颗粒(nano-Ag)的协同催化作用，增强电致化学发光(ECL)免疫检测信号，构建超灵敏的ECL免疫传感器，检测血清中肿瘤标志物CA125的表达水平。3．将酶与底物的循环催化应用到电致化学发光检测中，利用过氧化氢酶(HRP)与H2O2底物反应催化过硫酸根离子(S2O82-)的阴极电致化学发光信号，建立基于酶催化的非标记型ECL免疫传感器，检测血清中肿瘤标志物CEA的表达水平。4．初步探讨同界面多标记的多组分免疫检测技术，利用不同探针分子掺杂Nafion@TiO2复合纳米颗粒，阳离子交换标记糖类蛋白抗体，建立一种可同步检测肺癌患者血清中CA19-9和CA15-3两种肿瘤标志物的免疫传感器。研究内容和方法1．四种肿瘤标志物在不同病理类型肺癌中的表达及其临床意义用蛋白芯片法检测肺癌组1021例及健康体检者827人血清中CA19-9、CEA、CA125及CA15-3的表达水平，并结合临床资料进行回顾性研究，分析不同病理类型肺癌中的表达及其临床意义。通过相关数据的总结联合其他诊断方法更好的完成对肺癌的早期诊断、病理分型和TNM分期，有效监测病情变化。同时，统计分析上述肿瘤标志物联合检测的灵敏度、特异度和准确度，筛选出适用于肺癌早期诊断的联合检测用肿瘤标志物。2．基于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶(NADH)和银纳米颗粒(nano-Ag)协同催化的信号增强型电致化学发光(ECL)免疫传感器研究将金属－有机复合纳米材料引入到生物标记技术，以具有ECL催化性能的银纳米颗粒为载体，与具有共反应催化联吡啶钌ECL信号性能的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶(NADH)相掺杂，利用银金属纳米颗粒与NADH有机物的协同循环催化能力催化电化学发光，从而放大免疫检测信号，构建超灵敏ECL传感器用于血清样品中肿瘤标志物CA125的测定。3．过氧化氢酶催化过硫酸钾(S2O82-)阴极电致化学发光构建非标记型免疫传感器对肿瘤标志物CEA的检测利用酶与底物反应产生大量溶解氧，催化增强S2O82-的阴极ECL信号，构建非标记型免疫传感器。基于抗原蛋白在电极表面的结合，屏蔽了检测液中底物与电极表面固载酶之间的接触，使ECL信号强度随抗原浓度增加而减小，建立ECL信号与待测物浓度之间的线性依赖关系，实现对血清中肿瘤标志物CEA的快速超灵敏检测。4．探针分子掺杂Nafion@TiO2复合纳米颗粒阳离子交换标记糖类蛋白的双组分同步电化学免疫测定CA19-9和CA15-3以Nafion包裹TiO2的复合纳米颗粒(Nafion@TiO2)为载体，选择易于质子化带正电荷且氧化还原峰电位间隔大于0.2V的亚甲基蓝(MB)和联吡啶钴(Co)分子为探针，分别掺杂复合纳米颗粒，并通过阳离子交换标记抗体anti-CA19-9和anti-CA15-3，基于在同一电极表面夹心免疫结合探针标记的抗体，构建一种新型多组分同步检测的电化学免疫传感器，用于CA19-9和CA15-3两种糖类蛋白标志物的联合测定。研究结果1．四种肿瘤标志物在不同病理类型肺癌中的表达及其临床意义1)四种标志物在肺癌组及健康体检组中的表达情况：CA19-9、CEA、CA125及CA15-3血清表达水平在1021例肺癌患者及827例健康体检组的表达水平具有显著性差异(P<0.01)。2)不同病理类型肺癌中血清肿瘤标志物阳性率比较：1021例肺癌患者，按病理分型，腺癌392例(38.39%)、鳞癌386例(37.80%)、小细胞肺癌243例(23.80%)。非小细胞肺癌患者血清肿瘤标志物CA19-9、CEA、CA125及CA15-3的阳性率均明显高于小细胞肺癌，差异有统计学意义。CEA阳性率在腺癌患者血清中最高(达55.35%)，明显高于鳞癌组的阳性率(26.68%)和小细胞肺癌组的阳性率(25.92%)；CA125次之，在腺癌患者血清中达41.07%，明显高于鳞癌组的阳性率(27.72%)和小细胞肺癌组的阳性率(29.62%)；CA19-9和CA15-3表达的阳性率在腺癌组明显高于鳞癌组和小细胞肺癌组。3) ROC曲线对四种肿瘤标志物鉴别诊断不同病理类型肺癌的准确性评估：CA19-9对肺腺癌组的诊断准确性较高，ROC曲线下面积为0.617，并且以0.5为对照，有统计学意义；CEA对肺腺癌组及小细胞肺癌组的诊断准确性较好，ROC曲线下面积分别为0.697和0.446，有统计学意义；CA125对肺腺癌组及小细胞肺癌组诊断的准确性较高，其ROC曲线下面积下分别为0.600和0.440，有统计学意义；CA15-3对肺腺癌组诊断的准确性较高。4)四种标志物在肺癌不同病理类型诊断中的灵敏度和特异性：四种肿瘤标志物单项检测时的灵敏度均不高， CEA(37.5%)， CA125(33.3%)， CA19-9(14.8%)、CA15-3(6.8%)；四种标志物在不同病理类型肺癌的敏感性显著不同(P<0.05)，肺腺癌中的敏感性高于肺鳞癌和小细胞肺癌。5)联合检测四种肿瘤标志物的临床意义：以四种肿瘤标志物多种组合，以健康体检组为对照，分别计算两项组合、三项组合及四项组合的敏感性、特异性和准确性。两项联合时，CEA+CA125联合检测的敏感性最高19.01%，其次是CA19-9+CEA组合为10.68%；三项联合检测时组合间敏感性差别不明显；四项标志物联合检测时，灵敏度仅为1.96%。联合检测时，随着检测项目的增加，敏感性降低，但特异性均在98%以上，四项联合检测时，对肺癌诊断具有最高的特异性达100%。2．基于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶(NADH)和银纳米颗粒(nano-Ag)协同催化的信号增强型电致化学发光(ECL)免疫传感器研究1)该ECL免疫传感器对CA125检测的线性范围为0.1-150U/mL，检测限为0.03U/mL。且对比实验显示金属-有机酶复合纳米材料协同催化，比任何单一组分对ECL信号的增强程度都要大。2)该免疫传感器具有良好的特异性、重现性和稳定性。3)对比目标免疫传感器和ELLSA法对肿瘤患者和健康人群血清样本中的CA125检测结果，显示目标免疫传感器对血清中CA125抗原检测与ELLSA法检测结果有一致性，且目标免疫传感器有更低的检测下限，能初步应用于血清中CA125抗原检测。3．过氧化氢酶催化过硫酸钾(S2O82-)阴极电致化学发光构建非标记型免疫传感器对肿瘤标志物CEA的检测1)酶催化可显著放大S2O82-的阴极ECL信号，以直接免疫法，构建非标记型免疫传感器对CEA抗原检测，检测限可达1.04ng/mL。2)该免疫传感器具有良好的选择性和特异性。3)与前期工作相比，本研究成功将酶联免疫技术应用于ECL免疫分析中，可提高ECL免疫检测灵敏度，用于痕量肿瘤标志物检测。4．探针分子掺杂Nafion@TiO2复合纳米颗粒阳离子交换标记糖类蛋白的双组分同步电化学免疫测定CA19-9和CA15-31)以Nafion@TiO2复合纳米颗粒为载体，通过阳离子交换标记，将不同电化学探针标记于不同糖类蛋白抗体上，避免共价标记对抗体活性的影响。2)基于上述标记抗体，成功实现对CA19-9和CA15-3两种糖类蛋白标志物的电化学联合测定。目标免疫传感器对CA19-9的检出限为1.6U/mL，对CA15-3的检出限为0.3U/mL。3)将该免疫传感器用于人血清中CA19-9和CA15-3的加标回收测定，结果表明该免疫传感器对双组分抗原具有较好的双组分同步检测特异性和重现性。结论1．四种肿瘤标志物在不同病理类型肺癌中的表达及其临床意义CA19-9、CEA、CA125及CA15-3四种肿瘤标志物对肺腺癌诊断的准确性较高，多项联合检测能明显增加诊断的特异性，研究针对这类标志物联合检测的免疫传感器，有利于早期肺癌的快速发现和诊断，对肺癌防控有重要意义。2．基于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶(NADH)和银纳米颗粒(nano-Ag)协同催化的信号增强型电致化学发光(ECL)免疫传感器研究成功研制一种基于金属-有机酶复合纳米材料标记的ECL免疫传感器，使用夹心免疫分析模式，实现对人体血清中CA125的测定。该方法将金属与有机酶的协同催化作用，应用到ECL信号放大中，提高了ECL免疫分析灵敏度，为临床检测用ECL传感器发展打下基础。3．过氧化氢酶催化过硫酸钾(S2O82-)阴极电致化学发光构建非标记型免疫传感器对肿瘤标志物CEA的检测成功研制了一种非标记型的ECL酶联免疫技术，用于构建针对肿瘤标志物CEA检测的免疫传感器，该免疫传感器利用酶催化阴极电致化学发光，并用于对血清中痕量CEA检测，为临床肿瘤标志物检测提供了新的方法。4．探针分子掺杂Nafion@TiO2复合纳米颗粒阳离子交换标记糖类蛋白的双组分同步电化学免疫测定CA19-9和CA15-3成功构建了基于阳离子交换标记的多组分同步检测电化学免疫传感器，并对CA19-9和CA15-3进行同步测定，具有特异性强、检测快速、成本低廉的特点，建立了血清学辅助肺癌诊断的临床快速检测方法。