目的本课题拟基于原位自组装多肽构建一种用于检测和治疗革兰氏阳性细菌感染的多功能探针（AIEgen-peptide-Van）。该探针以具有自组装性能的短肽为骨架,以具有聚集诱导发光特性的分子（Aggregation-Induced Emission,AIEgen）为响应性荧光信号,以万古霉素为靶向基团。该探针可以通过靶向到细菌壁中的D-Ala-D-Ala序列并结合,诱发分子自组装,限制AIEgen的分子内旋转而开启其荧光,同时自组装能够增强AIEgen的活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）产生能力,最终实现对革兰氏阳性细菌的体内外特异性检测和高效光动力杀伤。方法1.探针合成和表征:固相多肽合成法（Solid-Phase Peptide Synthesis,SPPS）合成N₃-^DF^DF^DY^DEG^DK作为自组装因子,将万古霉素通过马来酸酐活化酯共价修饰到赖氨酸（K）侧链上,得到N₃-^DF^DF^DY^DEG^DK-Van。合成具有电子供体-受体结构的AIEgen分子(（4-（4-（2,2-双（4-甲氧基苯基）-1-苯基乙烯基）苯基）吡啶基溴丁炔,简称为TPEPy-Butyne）,通过点击化学反应将TPEPy-Butyne连接到自组装多肽上,合成AIEgen-peptide-Van。利用核磁和高分辨质谱对中间产物及终产物实现结构表征。2.探针体外性能研究:通过紫外吸收光谱特征峰和荧光发射光谱验证探针的特征结构和聚集发光性能;通过动态光散射（Dynamic Light Scattering,DLS）考察探针体外自组装能力;通过探针与自组装多肽（Nap-G^DF^DFG）的共组装研究自组装行为诱导探针聚集之后发光的能力;通过冷光源白光激发下探针的ROS产生（包括单线态氧¹O₂和超氧化物O₂^-）定量研究探针的光动力杀伤（Photodynamic Therapy,PDT）性能。3.探针体外细菌检测和杀伤研究:通过激光扫描共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy,CLSM）成像、荧光发射光谱600 nm特征峰峰值变化等手段研究探针对不同种类细菌的特异性结合;通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）成像研究探针组装体微观形貌;以具有化学发光的转基因金黄色葡萄球菌S.aureus Xen 36为模型菌研究探针的灵敏性。4.探针体内细菌感染检测与杀菌研究:通过细胞活力测定、溶血实验以及组织病理切片H&E染色等对探针的生物相容性进行综合评定;构建革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌等荷菌小鼠模型,通过小动物活体荧光成像、活体双光子共聚焦显微成像以及小动物化学发光成像对探针的体内检测和杀菌性能进行研究。结果1.探针合成和表征:¹H NMR,¹³C NMR,LC-MS和HR-MS等表征数据表明AIEgen、N₃-^DF^DF^DY^DEG^DK、N₃-^DF^DF^DY^DEG^DK-Van和终产物的成功合成。2.探针体外性能研究:动态光散射数据表明探针的临界自组装浓度（Critical assembly concentration,CAC）为14.52μM;体外组装后荧光发射光谱600 nm特征峰急剧升高表明探针AIE性能明显;单线态氧（¹O₂）和超氧化物（O₂^-）的高效产生表明自组装增强了AIEgen的ROS产生能力。3.探针体外细菌检测和杀伤研究:探针体外与不同菌株孵育后的荧光信号变化、CLSM成像均表明探针能够靶向成像革兰氏阳性细菌;初步结果表明探针的信号强度与菌株对万古霉素的不同程度耐药性直接相关;探针对S.aureus Xen36的检出限为2.4×10³ CFU/m L,说明探针具有较高灵敏性;TEM结果表明探针分子在革兰氏阳性细菌表面组装形成类似球形的不定形纳米形貌。4.探针体内细菌感染原位检测与杀菌研究:小动物活体荧光成像和活体双光子共聚焦显微成像结果均表明,探针经尾静脉注射能够在细菌感染部位点亮荧光并蓄积,在2 h达到最高水平,可以实现革兰氏阳性细菌感染的快速、高灵敏检测;小动物化学发光成像表明经过两次光动力治疗后细菌感染基本治愈。结论本研究基于万古霉素修饰的自组装多肽和具有发光和治疗功能的AIEgen,开发了原位自组装探针用于革兰氏阳性细菌感染的高灵敏诊断和高效治疗。探针检测可以实现较高的灵敏度和较强的体内靶向能力。由于基于自组装多肽的探针分子的结构可修饰性强,通过修饰不同的靶向基团和连接不同的AIEgen可以获得多种菌株特异性探针。因此,我们的设计可以发展成为构建多功能细菌诊断探针的通用策略,指导临床抗生素的合理使用。此外,良好的体内外生物相容性也表明此类探针分子在细菌感染的可视化治疗和诊疗一体化中具有潜在的应用价值。