【摘 要】
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脂肪酸合酶（fatty acid synthase,FASN）是内源性脂肪酸合成的关键酶,在脂代谢相关研究中具有重要意义。乙酰/丙二酸单酰基转移酶（Acetyl-CoA and malonyl-CoA transacylases,MAT）是脂肪酸合酶的一个功能域。反刍动物的MAT功能域在脂肪酸从头合成过程中同时具有起始活性、延长活性与终止活性,对动物机体合成短、中链脂肪酸起关键作用。本研究通过设计
【基金项目】
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国家科技重大专项转基因新品种培育（No.2018ZX0800802B）； 国家自然科学基金（No.31772575）；
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脂肪酸合酶（fatty acid synthase,FASN）是内源性脂肪酸合成的关键酶,在脂代谢相关研究中具有重要意义。乙酰/丙二酸单酰基转移酶（Acetyl-CoA and malonyl-CoA transacylases,MAT）是脂肪酸合酶的一个功能域。反刍动物的MAT功能域在脂肪酸从头合成过程中同时具有起始活性、延长活性与终止活性,对动物机体合成短、中链脂肪酸起关键作用。本研究通过设计针对MAT区域的sgRNA进行诱导,利用CRISPR/Cas9系统成功在奶山羊乳腺上皮细胞中敲除MAT片段,得到MAT显著降低的乳腺上皮细胞模型。以敲除细胞为试验材料进行脂代谢功能研究,为探究MAT基因敲除对乳腺脂肪酸代谢的影响提供了试验材料与理论基础。本研究的主要结果如下:1.成功筛选出可用于功能检测的MAT敲除细胞。通过T7EN1酶切得到六个对MAT结构域有切割效率的sgRNA,切割效率为sgRNA1 13.89%,sgRNA2 10.02%,sgRNA3 2.29%,sgRNA4 13.55%,sgRNA5 5.24%,sgRNA6 15.65%。其中6号细胞团切割效率最高,两条链分别缺失4bp与2bp,其MAT的m RNA水平表达量降低87.87%,FASN蛋白水平降低51.83%,生长状态良好,未发生脱靶现象,可作为脂肪酸功能检测试验材料。2.MAT敲除对山羊乳腺上皮细胞脂肪酸代谢的影响。山羊乳腺上皮细胞中MAT的敲除显著降低细胞中甘油三酯的含量（P<0.05）;同时敲除细胞内的乙酰辅酶A含量显著升高（P<0.05）;敲除细胞中LPL,GPAM,DGAT2,AGPAT6,PLIN2,XDH,ATGL,LXRα,PPARg基因的m RNA表达水平均显著降低（P<0.05）,SCD1基因m RNA表达水平显著升高（P<0.05）;敲除MAT使乳腺上皮细胞中短中链脂肪酸相对含量下降（P<0.05）,细胞中不饱和脂肪酸含量上升（P<0.05）,饱和与不饱和脂肪酸比值显著下降（P<0.05）。通过CRISPR/Cas9技术,成功在奶山羊乳腺上皮细胞中敲除MAT基因,并以此为材料验证了敲除MAT对脂代谢的影响,为研究奶山羊乳腺脂代谢机理奠定了理论基础。
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