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遗传性凝血因子Ⅴ(coagulationfactorⅤ，FⅤ)缺陷症是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病，患病率约为100万分之一。患者临床表现差异较大，常出现轻重不等的出血症状。遗传性低纤维蛋白原血症(congenitalhypofibrinogenemia)主要由于纤维蛋白原基因缺陷而导致的纤维蛋白原（Fibrinogen，Fg）分子结构及功能异常的遗传性疾病，属于一种罕见病，可表现为出血或血栓形成。
目的
本研究通过对一个遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症和一个遗传性低纤维蛋白原血症患者家系进行表型分析和基因检测，旨在寻找致病的突变基因，用生物信息学相关软件对突变位点加以分析，初步探讨两种遗传性疾病的分子发病机制。
方法
1、实验室表型检查：采用凝固法检测血浆凝血酶原时间(prothrombinTime，PT)、活化部分凝血活酶时间(activatedpartialthromboplastintime，APTT)、凝血酶时间(thrombintime，TT)、凝血因子Ⅱ活性（coagulationfactorⅡactivity，FⅡ:C）、凝血因子Ⅴ活性（coagulationfactorⅤactivity，FⅤ:C）、凝血因子Ⅶ活性（coagulationfactorⅦactivity，FⅦ:C）、凝血因子Ⅹ活性（coagulationfactorⅩactivity，FⅩ:C）和血浆纤维蛋白原活性(fibrinogenactivity，Fg:C)；采用酶联免疫吸附法（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）检测FⅤ抗原(coagulationfactorⅤantigen，FⅤ:Ag)含量；免疫比浊法检测纤维蛋白原抗原(fibrinogenantigen，Fg:Ag)含量。
2、基因检测：抽提先证者及其家系成员的基因组DNA，采用聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）扩增F5基因和纤维蛋白原的FGA、FGB及FGG基因的所有外显子区域及其侧翼序列，发现突变位点后用反向测序予以证实，并检测其家系成员相应的突变位点区域。
3、生物信息学特性分析：采用ClustalX-2.1-win软件分析氨基酸突变位点的保守性；用MutationTaster在线生物信息学软件分析突变对蛋白质功能的影响；用Swiss-PdbViewer软件对突变位点进行蛋白模型和氨基酸相互作用分析。
结果
一、在遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症家系中：
1、先证者的PT和APTT均轻度延长，分别为15.7s/13.5s和46.6s/36.0s；其FⅤ:C和FⅤ:Ag均明显下降，分别为39%和47%。其母亲、大女儿和儿子PT和APTT也均稍延长，FⅤ:C和FⅤ:Ag也有不同程度下降（为正常对照的50%左右）。
2、基因测序结果显示，先证者F5基因的第22号外显子存在c.6175C>T杂合无义突变，导致p.Gln2031stop；其母亲、大女儿和儿子均存在p.Gln2031stop突变杂合子；其姐姐、妻子、弟弟均为野生型。
3、保守性分析结果显示，p.Gln2031在同源物种中为弱保守。生物信息学软件对该突变的预测结果：MutationTaster（评分1.000分）结果预示可引起相应疾病。突变蛋白模型分析显示：在野生型FⅤ蛋白质中，存在完整组织域(A1-A2-B-A3-C1-C2)，当发生c.6175C>T杂合无义突变后，在蛋白质C1结构域第2031号开始至C2结构域的所有肽链合成均提前终止，形成一条不完整的多肽链，产生截短蛋白。
二、在遗传性低纤维蛋白原血症家系中：
1、先证者的PT、APTT、TT均有不同程度延长，Fg:C和Fg:Ag明显降低，分别为0.66g/L和0.72g/L（两者参考范围均为2.0~4.0g/L），纤维蛋白原活性和抗原比值（Fg:C/Fg:Ag）为0.92，显示活性与抗原同步降低；其母亲和外祖母PT、APTT、TT也均延长，Fg:C和Fg:Ag同步降低；其父亲及外公血浆各相关凝血指标均在正常范围。
2、基因测序结果显示，先证者的FGG基因第8号外显子上存在c.7590G>T杂合错义突变，导致D结构域的313位丝氨酸被替换成异亮氨酸（p.Ser313Ile）；其母亲和外祖母也为p.Ser313Ile杂合子，其他家系成员则为野生型。该突变在国内外尚属首次发现。
3、突变蛋白模型分析显示，在野生型的蛋白质中，Ser313的主干分别与Asn319、Asp320和Trp334的主干形成3个氢键；而Ser313突变为Ile后，与Asn319、Asp320之间的氢键消失，可能影响Fg的构象稳定性以及与Ca2+的正常结合。而原本为中性极性的Ser313，突变为疏水性非极性的Ile后，其侧链变长，也可能影响纤维蛋白原的构象、折叠和稳定性，从而引起纤维蛋白原水平降低。
结论
1、遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症家系先证者的FⅤ:C和FⅤ:Ag明显下降，表现为Ⅰ型凝血因子Ⅴ缺陷症，突变基因为F5基因p.Gln2031stop杂合无义突变。
2、遗传性低纤维蛋白原血症家系先证者的Fg:C和Fg:Ag同步降低，表现为Ⅰ型低纤维蛋白原血症，突变基因为FGG基因p.Ser313Ile杂合错义突变。
3、两个家系先证者FⅤ和Fg血浆水平降低分别与p.Gln2031stop和p.Ser313Ile基因突变有关。
4、遗传性低纤维蛋白原血症的p.Ser313Ile杂合错义突变为国际上首次报道。
目的
本研究通过对一个遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症和一个遗传性低纤维蛋白原血症患者家系进行表型分析和基因检测，旨在寻找致病的突变基因，用生物信息学相关软件对突变位点加以分析，初步探讨两种遗传性疾病的分子发病机制。
方法
1、实验室表型检查：采用凝固法检测血浆凝血酶原时间(prothrombinTime，PT)、活化部分凝血活酶时间(activatedpartialthromboplastintime，APTT)、凝血酶时间(thrombintime，TT)、凝血因子Ⅱ活性（coagulationfactorⅡactivity，FⅡ:C）、凝血因子Ⅴ活性（coagulationfactorⅤactivity，FⅤ:C）、凝血因子Ⅶ活性（coagulationfactorⅦactivity，FⅦ:C）、凝血因子Ⅹ活性（coagulationfactorⅩactivity，FⅩ:C）和血浆纤维蛋白原活性(fibrinogenactivity，Fg:C)；采用酶联免疫吸附法（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）检测FⅤ抗原(coagulationfactorⅤantigen，FⅤ:Ag)含量；免疫比浊法检测纤维蛋白原抗原(fibrinogenantigen，Fg:Ag)含量。
2、基因检测：抽提先证者及其家系成员的基因组DNA，采用聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）扩增F5基因和纤维蛋白原的FGA、FGB及FGG基因的所有外显子区域及其侧翼序列，发现突变位点后用反向测序予以证实，并检测其家系成员相应的突变位点区域。
3、生物信息学特性分析：采用ClustalX-2.1-win软件分析氨基酸突变位点的保守性；用MutationTaster在线生物信息学软件分析突变对蛋白质功能的影响；用Swiss-PdbViewer软件对突变位点进行蛋白模型和氨基酸相互作用分析。
结果
一、在遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症家系中：
1、先证者的PT和APTT均轻度延长，分别为15.7s/13.5s和46.6s/36.0s；其FⅤ:C和FⅤ:Ag均明显下降，分别为39%和47%。其母亲、大女儿和儿子PT和APTT也均稍延长，FⅤ:C和FⅤ:Ag也有不同程度下降（为正常对照的50%左右）。
2、基因测序结果显示，先证者F5基因的第22号外显子存在c.6175C>T杂合无义突变，导致p.Gln2031stop；其母亲、大女儿和儿子均存在p.Gln2031stop突变杂合子；其姐姐、妻子、弟弟均为野生型。
3、保守性分析结果显示，p.Gln2031在同源物种中为弱保守。生物信息学软件对该突变的预测结果：MutationTaster（评分1.000分）结果预示可引起相应疾病。突变蛋白模型分析显示：在野生型FⅤ蛋白质中，存在完整组织域(A1-A2-B-A3-C1-C2)，当发生c.6175C>T杂合无义突变后，在蛋白质C1结构域第2031号开始至C2结构域的所有肽链合成均提前终止，形成一条不完整的多肽链，产生截短蛋白。
二、在遗传性低纤维蛋白原血症家系中：
1、先证者的PT、APTT、TT均有不同程度延长，Fg:C和Fg:Ag明显降低，分别为0.66g/L和0.72g/L（两者参考范围均为2.0~4.0g/L），纤维蛋白原活性和抗原比值（Fg:C/Fg:Ag）为0.92，显示活性与抗原同步降低；其母亲和外祖母PT、APTT、TT也均延长，Fg:C和Fg:Ag同步降低；其父亲及外公血浆各相关凝血指标均在正常范围。
2、基因测序结果显示，先证者的FGG基因第8号外显子上存在c.7590G>T杂合错义突变，导致D结构域的313位丝氨酸被替换成异亮氨酸（p.Ser313Ile）；其母亲和外祖母也为p.Ser313Ile杂合子，其他家系成员则为野生型。该突变在国内外尚属首次发现。
3、突变蛋白模型分析显示，在野生型的蛋白质中，Ser313的主干分别与Asn319、Asp320和Trp334的主干形成3个氢键；而Ser313突变为Ile后，与Asn319、Asp320之间的氢键消失，可能影响Fg的构象稳定性以及与Ca2+的正常结合。而原本为中性极性的Ser313，突变为疏水性非极性的Ile后，其侧链变长，也可能影响纤维蛋白原的构象、折叠和稳定性，从而引起纤维蛋白原水平降低。
结论
1、遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症家系先证者的FⅤ:C和FⅤ:Ag明显下降，表现为Ⅰ型凝血因子Ⅴ缺陷症，突变基因为F5基因p.Gln2031stop杂合无义突变。
2、遗传性低纤维蛋白原血症家系先证者的Fg:C和Fg:Ag同步降低，表现为Ⅰ型低纤维蛋白原血症，突变基因为FGG基因p.Ser313Ile杂合错义突变。
3、两个家系先证者FⅤ和Fg血浆水平降低分别与p.Gln2031stop和p.Ser313Ile基因突变有关。
4、遗传性低纤维蛋白原血症的p.Ser313Ile杂合错义突变为国际上首次报道。