论文部分内容阅读
光合作用是自然界几乎一切生命生存和发展的物质基础。高等植物和一些藻类通过特有的细胞器叶绿体(Chloroplast)完成这一生化反应以保证自身的生长需要。近年来对叶绿体蛋白进行研究发现,大量存在于叶绿体中的类囊体蛋白也参与光合作用的过程。亲免蛋白(immunophilins)作为免疫抑制剂的胞内受体在动物体中发现,介导免疫抑制。亲免蛋白广泛分布于生物体中,其中在植物中数量最多。CYP38(Cyclophilin 38)是拟南芥亲免蛋白家族中的一员,其对光合作用光系统Ⅱ(Photosystem II,PSⅡ)的组装及稳定性的维持有着重要的作用,但组装机制并不清楚。At4g24930和At1g21500是通过酵母双杂交筛选得到的CYP38的互作蛋白,那么这两个蛋白是否能帮助CYP38共同参与PSⅡ的组装,或者它们自身的功能是否跟光合作用有关,目前还不清楚。所以本论文主要是对At4g24930和At1g21500的功能进行初步的探究,同时确定其与CYP38功能之间的关系。通过生物信息学分析可知,At4g24930含有162个氨基酸,成熟蛋白大小为17.9k Da,理论等电点为5.06,未预测到特殊结构域。At1g21500含有67个氨基酸,成熟蛋白大小为7.3 k Da,理论等电点为10.06,未预测到特殊结构域。拟南芥e FP Brower网站预测At4g24930和At1g21500基因主要在绿色组织器官中表达。进化分析表明拟南芥At4g24930、At1g21500的同源物种很少,且都是高等植物,说明这两个基因在高等植物光合作用方面可能有重要作用。为了研究该基因的功能,我们首先通过CRISPR-Cas9基因编辑技术并经过筛选分别得到了At4g24930和At1g21500基因的两个不同株系的纯合突变体。对At4g24930和At1g21500做了亚细胞定位和Western分析,发现这两个基因都位于叶绿体的类囊体腔中。通过体内酵母双杂交和体外Pull Down验证了这两个蛋白都能与CYP38的C端功能域互作。在正常光及变光条件下,At4g24930突变体At4g24930-m1,At4g24930-m2植株与野生型无明显差别。但高光胁迫下叶片明显变紫,盐胁迫下叶片边缘发黄,表明植物对高光、盐敏感。高光处理后,通过Blue Native PAGE观测到At4g24930-m1突变体相比于野生型,C2S2M2条带减少,表明At4g24930基因在高光胁迫时,对于超级复合体的富集有一定的影响,可能参与了植物响应高光的生理机制。在正常光下,At1g21500突变体At1g21500-m1,At1g21500-m2突变体与野生型相比晚抽薹3天,变光条件下晚薹更明显。高光胁迫下花青素含量测定结果与野生型无明显差异。通过Blue Native PAGE检测正常光下的光合复合体,发现无明显变化。这些结果表明,At1g21500可能影响植物生长。将这两个基因的单突变体分别与cyp38-2突变体杂交得到纯合双突,发现植株矮小、叶片发黄、发育迟缓,在高光条件下致死。以上通过对At4g24930和At1g21500基因功能的初步探究,表明At4g24930和At1g21500与CYP38确实存在互作,并且At4g24930在高光下可能参与PSII的组装,At1g21500影响植物的生长,这两个基因可能通过某种方式共同影响拟南芥的光合效率,同时为后续研究提供依据。