日本沼虾(Macrobrachium nipponense),俗称青虾,是我国重要的淡水经济虾类。然而,由于工业化的迅速发展,环境恶化问题成为虾养殖产业的限制性因素,并造成巨大经济损失。而氨氮是水体中常见的环境胁迫因子,过高的浓度会严重影响日本沼虾的免疫系统和生长发育。因此,探究日本沼虾抵抗氨氮胁迫的分子机理为提高虾类的免疫功能、保护日本沼虾的种质资源和培育抗逆品种奠定理论基础。gC1qR是一个分子量为33 kD单链的蛋白质,属于C1q受体家族,是一种表达广泛,多功能性的蛋白质;在脊椎和无脊椎动物的先天性免疫中发挥着重要的作用,可以保护机体抵抗病毒、细菌、不良环境的干扰。gC1qR可以在各种组织和细胞以及细胞表面表达。而在细胞表面表达的gC1qR蛋白质可以作为胞外、胞内、微生物以及病毒蛋白分子的受体,因此被称为多功能伴侣。本研究以日本沼虾为实验材料,随机分为对照组和处理组。对照组的日本沼虾饲养在正常水体不做任何处理,而处理组的日本沼虾饲养在氨氮浓度为98 mg/L的水体中。在处理0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h后采集各组组织样品放于-80℃保存,用于RNA的提取、各种酶(PO、LSZ、SOD、CAT)活力的测定、组织切片、RACE克隆、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blot以及RNAi等。主要研究结果如下:(1)日本沼虾肝胰腺组织中酶活力测定结果显示:与对照组相比,处理组中SOD和CAT酶活力分别在12 h和24 h时显著性升高而48 h时显著降低,表明高浓度的氨氮胁迫在短时间内能够引起日本沼虾机体的氧化应激;而长时间的氨氮胁迫会导致机体的氧化损伤。PO和LSZ酶活力分别在3 h和6 h显著上升,这可能与氨氮胁迫诱导了日本沼虾非特异性免疫反应有关;而从12 h至96 h这段时间两种酶的活力都显著降低,表明日本沼虾长时间处于高浓度的氨氮水体中机体的免疫系统会受到损伤。(2)组织学分析显示,对照组日本沼虾的胰腺管结构完整良好,而高浓度的氨氮环境下的日本沼虾肝胰腺组织的损伤随着胁迫时间的延长越来越严重:胰腺管明显的肿大,管壁变薄,管与管间的间隙减小,空泡增多增大;星状管腔失去原有的形状,趋向圆形;甚至出现碎裂的细胞核和脱落的细胞组织。(3)首次通过RACE和RT-PCR技术克隆了gC1qR基因的cDNA全序列,长度为1164 bp,包含一个774 bp的开放阅读框(ORF),106 bp的5′UTR(非翻译区)和284bp的3′UTR,3′区加尾信号序列AATAAA和3′Poly(A)尾。此外,对gC1qR基因的开放阅读框进一步分析,发现ORF编码了257个氨基酸,预测蛋白分子量是28.73 kDa,等电点是4.643,其中包含24个碱性氨基酸,41个酸性氨基酸,75个疏水性氨基酸,74个极性氨基酸。此外,日本沼虾gC1qR基因编码的蛋白质包含一个MAM33结构域和一个RGD基序。序列比对和进化树分析表明,日本沼虾gC1qR基因与甲壳类动物的进化关系更为密切并且与罗氏沼虾和脊尾白虾具有较高的同源性。(4)采用qRT-PCR和Western blot检测了不同组织在不同处理时间点下日本沼虾gC1qR基因的表达情况。结果表明:该基因在日本沼虾的肝胰腺、鳃、胃、肌肉、眼柄和心脏组织中均有表达。肝胰腺和鳃组织中表达量最高,眼柄中表达量最低。与对照组相比,日本沼虾gC1qR基因在肝胰腺和鳃组织的表达量从3 h开始上升,12 h显著升高并达到最大值,然后24 h开始下降并在48 h达到最低值,96 h逐渐达到初始表达量。从蛋白水平上看,Western blot结果表明日本沼虾gC1qR基因在各组织中均有表达,各组织在蛋白水平上的表达量和转录水平的表达量基本一致。(5)采用dsRNA介导的RNAi技术将日本沼虾gC1qR基因沉默,本实验分为PBS+ammonia-N组、dsGFP+ammonia-N组和dsgC1qR+ammonia-N组。通过qRT-PCR和Western blot检测dsRNA的沉默效率和沉默后的日本沼虾gC1qR基因在各时间点的表达情况并记录沉默后的日本沼虾在氨氮胁迫下各时间点死亡率。qRT-PCR和Western blot结果显示:当日本沼虾被注射dsgC1qR后,在48 h时该基因的表达量显著降低并达到最低值,说明dsgC1qR在48 h时的沉默效率最高并且是有效的。然后对gC1qR基因沉默后的日本沼虾进行氨氮胁迫,与PBS+ammonia-N组和dsGFP+ammonia-N组相比,dsgC1qR+ammonia-N组的日本沼虾死亡率显著升高,说明gC1qR在抵抗氨氮胁迫的过程中可能起着关键的作用。最后qRT-PCR检测了日本沼虾gC1qR基因在dsGFP+ammonia-N组和dsgC1qR+ammonia-N组中各个时间点的表达情况,结果显示:与dsgC1qR组相比,gC1qR的表达量在dsgC1qR+ammonia-N组中12 h是显著升高,表明gC1qR表达量的升高主要原因是短时间内氨氮的诱导表达。综上所述,首次克隆日本沼虾gC1qR基因的全长cDNA并进行了该基因的序列对比和进化树分析。氨氮胁迫后多种与免疫有关的酶的酶活力也被测定并显示出短时间内酶活力明显的上调和一段时间后明显的下降,说明高浓度的氨氮会影响日本沼虾的免疫系统。日本沼虾gC1qR基因可以在多种组织中表达,其中在肝胰腺和鳃组织中的表达量最高。氨氮胁迫后日本沼虾gC1qR的表达特征分析表明该基因可以被氨氮诱导,可能参与抗氨氮胁迫的免疫机制。RNA干扰进一步证明日本沼虾gC1qR基因的沉默会导致日本沼虾的死亡率显著升高。本实验所有的结果表明日本沼虾gC1qR基因可能在抗氨氮胁迫中具有关键的作用。