目的:中枢神经系统(Central Nervous System)感染是神经系统常见疾病,具有较高的致残率和病死率。病因主要为血脑屏障受到病原微生物侵袭发生了炎性改变,导致其结构破坏及功能下降,有证据表明,粘附连环蛋白家族参与了其中过程,但具体机制并不清楚。本实验通过体外模型,探讨P120连环蛋白(P120ctn)在脂多糖介导的血脑屏障紊乱及炎性反应中的功能。方法:我们主要利用人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells HBMECs)作为研究对象。HBMECs(2×104)种在胶原包被Fluoro Blok着色组织培养嵌套(孔径为3μm)上,将FITC标记的葡聚糖加入培养基中,最终的浓度为100ug/ml;同时用脂多糖刺激细胞,刺激浓度为1ug/ml;刺激的相应时间分别为0小时,3小时,6小时,12小时,24小时,从受体室中收集样本,并采用荧光分光光度计和酶标仪测量样本中的荧光素标记葡聚糖含量,根据PBS中荧光素标记葡聚糖生成的标准曲线计算样本中的荧光素标记葡聚糖浓度。通过蛋白印迹分析WB法检测P120ctn的蛋白水平。同时对FITC葡聚糖的含量与P120ctn的蛋白量进行相关性分析。为了进一步验证P120连环蛋白水平的变化与血脑屏障渗透性呈现相关性。首先,我们将HBMECs通过RNA干扰技术敲低P120ctn或利用腺病毒感染过表达P120ctn,分别通过免疫印记方法及real time PCR的方法检测P120ctn水平,用来验证我们的干扰RNA和腺病毒感染法能够改变细胞的P120ctn水平;然后通过FITC葡聚糖标记实验分别检测各组内皮细胞的渗透性,以及它们在脂多糖LPS(1ug/ml)刺激24小时情况下渗透性的变化。同时免疫印迹方法检测实验样品中紧密连接蛋白occludin、cldudin-5的蛋白水平,用来验证P120ctn通过影响细胞间紧密连接而影响血脑屏障的完整性。P120ctn不仅影响紧密连接的完整性,同时可能影响单核细胞的迁移。将从PBMC中分离出的单核细胞,内皮细胞分别设立敲低目的蛋白P120ctn组或过表达目的蛋白P120ctn组,以及对照组,用LPS或不用LPS刺激,检测单核细胞迁移情况。并且通过实时定量PCR方法检测基因MCP-1,IL-1β,CXCL1,ICAM-1,[II]VCAM-1,E-selectin的m RNA水平,用来验证P120ctn是否影响细胞因子的分泌。P120ctn通过什么途径影响炎性反应呢?我们在血管内皮细胞中瞬时转染NF-κB的荧光素酶报告基因,同样设立敲低目的蛋白P120ctn组或过表达目的蛋白P120ctn组,以及对照组,48小时候后LPS处理24小时,监测各组细胞的荧光素酶活性。深入探讨其机制,继续脂多糖刺激相应的时间点,采用免疫印迹方法检测细胞核内的P65和P50的含量,并检测细胞质中的piκbα、iκbα、ikkβ含量,分析各组表达量相关性。结果:我们发现通过脂多糖刺激,人脑微血管内皮细胞P120连环蛋白的水平明显降低,作用24小时,降到40%的程度,并且细胞渗透性的增加与P120连环蛋白水平的下降呈现负相关r=-0.8682,p<0.05,说明LPS介导的内皮细胞渗透性改变与P120连环蛋白表达存在负相关。通过腺病毒介导的过表达目的蛋白P120ctn,在MOI=100的时候P120连环蛋白水平明显上调;通过小干扰RNA对目的蛋白P120ctn进行敲低,如果转入20nm,就可以在蛋白水平明显敲低目的蛋白P120ctn的水平。通过LPS处理后,P120ctn与紧密连接相关蛋白occludin、claudin-5水平会出现下降,并且变化呈一种线性关系。表明在脂多糖刺激情况下,P120ctn通过影响内皮细胞紧密连接蛋白的表达而干扰血脑屏障的稳定性。从PBMC中分离出的单核细胞,脂多糖处理后,P120ctn敲低组的迁移能力强于较对照组,增加了大概有50%的迁移能力,提示P120ctn能够影响单核细胞的迁移。类似的结果,腺病毒介导的过表达P120ctn组,单核细胞的迁移量为对照组的一半左右。敲低P120ctn后,发现一些细胞因子:MCP-1、白介素-1β、CXCL1等表达明显地升高,提示P120ctn影响了细胞因子的分泌。瞬时转染NF-κB的荧光素酶报告基因,发现在脂多糖处理以后,荧光素酶的活力明显增强,说明内皮细胞被脂多糖激活了NF-κB信号通路;但与对照组比较,过表达P120ctn组荧光素酶的活力明显降低,提示P120ctn影响了NF-κB的激活。进一步研究表明,过表达P120ctn组细胞的P65和P50入核明显减少,说明P120ctn可以通过降低NF-κB亚基P65及P50向细胞核转运,从而抑制NF-κB信号通路的激活。深入研究,发现LPS处理后细胞质中piκbα含量增强,但其水平在P120ctn过表达组中明显低于对照组;同时胞质中iκbα水平会下降,但是在P120ctn过表达组中,其下降程度明显低于对照组,所以我们可以看出过表达P120ctn可以抑制iκbα磷酸化,从而抑制其被蛋白酶体降解,导致在过表达P120ctn组中iκbα被积累。Iκbα的磷酸化主要是通过ikk激酶,我们检测了ikkβ的蛋白水平,发现整体水平并没有明显的差别。继续追踪,我们检测了磷酸化ikkβ的水平,磷酸化ikkβ会随着脂多糖的刺激明显增强,但在过表达P120ctn组明显要低于对照组。所以综上,我们可以看出P120连环蛋白可以抑制ikkβ活化,进一步抑制了iκbα磷酸化,出现iκbα蛋白酶体介导的降解能力下降,从而导致NF-κB的激活下降。同样,通过敲低P120ctn,我们检测内皮细胞pikkβ、piκbα、iκbα的水平,检测到pikkβ在敲低P120ctn组明显高于对照组。说明敲低P120连环蛋白可以促进ikkβ以及iκbα的磷酸化,从而促进了下游NF-κB通路的激活。结论:P120连环蛋白通过影响紧密连接起到保护血脑屏障的作用;当机体受到病原体侵犯,通过抑制脑微血管内皮细胞NF-κB通路激活来抑制炎症反应。揭示了在中枢神经系统感染过程中,对于缓解血脑屏障紊乱以及炎症反应的过度激活,过表达P120连环蛋白可以作为一个新的治疗策略。