作为细胞膜上一类偶联细胞电活动和能量代谢状态的离子通道,KATP通道在人体内广泛分布,具有多种重要的生理学和病理生理学功能[1-3]。在正常能量代谢情况下,KATP通道基本处于关闭状态;当细胞能量代谢受抑制时,比如缺血、缺氧等情况下,胞内能量物质的改变(主要是ATP含量降低,而ADP含量升高)引起KATP通道开放,使细胞内K+的外流,细胞膜超极化,细胞的兴奋性减弱,进而参与多种细胞功能的调节[4-7]。因此,KATP通道在高血压等多种心血管疾病的发生发展过程中发挥着重要作用,作为一种新的防治药物靶标已引起广泛关注。分子生物学研究[1-3,10,11]表明KATP是由内向整流钾通道Kir亚基和磺酰脲类受体SUR亚基按1:1的比例构成的异源八聚体(Kir6.x/SUR)4复合物。参与KATP组成的Kir亚基主要是Kir6.x(包括Kir6.1、Kir6.2)和Kir1.1,其中Kir6.x在各种组织器官中广泛存在,而Kir1.1主要在肾脏中表达,它们决定着KATP通道的电生理学特性;SUR包围在Kir亚基的外部,包括SUR1、SUR2A和SUR2B三种亚型,被认为是内外源性通道调节剂(如核苷酸、KCOs和磺酰脲类阻断剂等)的作用靶点。各类亚基的不同亚型的基因和蛋白质序列有一定的同源性,但也存在明显差异,这种差异正是药物选择性作用的分子药理学基础。对比天然型和克隆表达的KATP通道的特性[11-19],目前一般认为,胰腺β细胞和多数神经元KATP由SUR1/Kir6.2组成,心肌和骨骼肌细胞的KATP由SUR2A/Kir6.2组成,非血管平滑肌KATP亚型主要是SUR2B/Kir6.2,而血管平滑肌和内皮细胞则主要为SUR2B/Kir6.1。另外,有研究表明线粒体膜KATP通道(mito KATP)的亚基组成与SUR1/Kir6.1最为接近[20]。正是由于不同亚型KATP通道分子组成的多样性,决定了不同组织中KATP通道有自己独特的电生理学、病理生理学和药理学特性,这也使得研发组织选择性强、副作用小的KATP通道开放剂成为可能。埃他卡林(Iptakalim,Ipt)是我国学者自主研发的一类新型KATP通道开放剂(KCO),具有不同于其他KCOs的全新化学结构类型。目前该药物已进入Ⅲ期临床的研究阶段,现有资料表明,Ipt有独特的药理学和治疗学优势,它能够选择性扩张阻力血管,其降压作用平稳确切,并且副作用少;具有高血压病理状态的选择性,对高血压患者效果显著而对正常受试者血压无影响。利用格列苯脲对KATP通道的特异性阻断作用和基因敲除模型,我们已经证实Ipt的扩血管作用、对高血压等多种因素导致的重要脏器损伤的保护和改善充血性心肌重构等作用都与激活血管平滑肌和内皮细胞上的KATP通道密切相关。纳他卡林(Natakalim,Nat)是Ipt的衍生物,与其有相同的母核和不同的侧基。前期研究表明,Nat有强效的内皮细胞保护作用,能显著改善心肌重构和心力衰竭,其作用也与开放血管内皮细胞上的KATP通道相关[20]。前期研究通过测定Di BAC4(3)荧光强度反映细胞膜电位的变化和部分膜片钳实验评价了埃他卡林对KATP通道的亚型选择性,但受限于评筛模型的低灵敏度和实验细胞的类型(某些天然细胞或表达部分亚型KATP通道的HEK293细胞),因此关于Ipt对KATP通道亚型选择性作用特点的认识还远不够全面充分。此外,Ipt表现出对高血压等病理状态的选择性,提示其作用可能与细胞的能量代谢状态相关,但还缺乏直接的实验证据。本研究将分子生物学、电生理学和药理学方法相结合,利用爪蟾卵母细胞作为表达载体建立了异源性表达不同亚型的功能性KATP通道细胞模型,并应用双电极电压钳技术,系统地研究了新型KCO对KATP通道的亚型选择性、其调节作用的能量代谢状态选择性,以及药物作用的分子药理学机制,包括其作用的亚单位靶点和受胞内能量物质调控的重要氨基酸位点。本研究将为直观全面的认识埃他卡林对KATP通道的选择性作用特征和深入了解其作用的分子机制提供重要的实验依据。第一部分不同亚型KATP通道在爪蟾卵母细胞中的表达及其功能性特征研究利用爪蟾卵母细胞作为表达载体,注射表达了不同SUR/Kir6.x组合的六种亚型KATP通道,然后应用双电极电压钳技术,系统地研究了六种亚型KATP通道的药理学和生理学(主要是对能量代谢抑制的敏感性)功能性特征。一、对照组卵母细胞对药物和能量代谢抑制的反应对药物和能量代谢抑制均无明显反应,证明卵母细胞自身无KATP通道的表达,可作为KATP通道的异源表达载体;单独的Kir6.x或SUR亚基不能在卵母细胞膜上表达形成功能性通道。二、不同亚型KATP通道的药理学特征吡那地尔和二氮嗪都可激活SUR2B/Kir6.x亚型KATP通道,且前者作用更强;吡那地尔可激活SUR2A/Kir6.x亚型KATP通道而二氮嗪无效;二氮嗪可激活SUR1/Kir6.x亚型KATP通道而吡那地尔无效。六种亚型KATP通道均可被格列苯脲和Ba2+显著抑制;5-HD高选择性地阻断SUR1/Kir6.x亚型KATP通道,且对SUR1/Kir6.1作用更强;PNU-37883A选择性抑制SUR/Kir6.1和SUR2B/Kir6.2亚型KATP通道。三、不同亚型KATP通道对能量代谢敏感性的差异3m M Na-azide作用于卵母细胞后造成细胞能量代谢受抑制,胞内ATP含量显著降低,而ADP/ATP比值显著增大。不同亚型KATP通道对Na-azide造成细胞能量代谢抑制的敏感性有显著差异,其代谢敏感性主要由SUR亚基决定,同时受Kir6.x亚基影响。第二部分新型KCO埃他卡林对KATP通道亚型选择性的研究本部分实验在表达六种亚型功能性KATP通道的卵母细胞上,首先研究了新型KCO埃他卡林对不同亚型KATP通道全细胞电流的作用特点,为阐明药物的亚型选择性作用提供直接全面的实验依据。进而,我们又观察了当细胞处于能量代谢抑制状态时,埃他卡林对不同亚型KATP通道的药理学作用特征。一、埃他卡林激活KATP通道的亚型选择性当细胞处于正常能量代谢状态时,表达的六种亚型KATP通道都处于关闭状态(静息态)。此时,Ipt可高选择性地激活SUR2B/Kir6.1亚型KATP通道,对其它亚型无显著作用;类似的,Nat高选择性地激活SUR2B/Kir6.1亚型KATP通道。二、细胞能量代谢受抑制时埃他卡林对不同亚型KATP通道的药理作用特征当SUR2B/Kir6.1亚型KATP通道被3m M Na-azide造成的能量代谢抑制预激活时,Ipt对通道电流的进一步激活作用与静息态相比更为显著且此激活效应可被磺酰脲类阻断剂Gli和非磺酰脲类阻断剂PNU-37883A剂量依赖性地拮抗;类似的,当细胞能量代谢受抑制时,Nat对SUR2B/Kir6.1通道的激活作用也显著增强。在细胞能量代谢抑制(或与KCO联用)使通道被预激活时,Ipt和Nat对SUR2A/Kir6.1和SUR1/Kir6.1亚型KATP通道都无显著作用;而对SUR/Kir6.2组合的三种亚型KATP通道电流有一定的抑制作用。第三部分新型KCO埃他卡林对KATP通道亚型选择性作用的分子机制的研究作为新型KCO,Ipt在KATP上作用的亚单位靶点是否也是SUR呢?它对Kir亚基是否有直接作用呢?前面的研究表明药物对SUR2B/Kir6.1通道的激活作用有能量代谢状态的选择性,那么胞内核苷酸类能量物质(如Mg ATP和Mg ADP)在SUR2B上的结合/水解是否影响药物对通道的激活作用呢?基于以上问题,本研究首先在单独表达Kir6.1ΔC45、Kir6.2ΔC36和Kir1.1通道的细胞模型上,采用电生理技术进一步深入明确了Ipt在KATP上的作用亚单位靶点;然后利用SUR2B突变体模型,初步揭示了与胞内能量物质调控药物对SUR2B/Kir6.1激活作用相关的重要氨基酸位点。一、埃他卡林在KATP通道上作用亚单位靶点的研究通过切除C末端的内质网滞留信号序列,单独的Kir6.x亚基(Kir6.1ΔC45和Kir6.2ΔC36)可在细胞膜上表达形成功能性通道。Kir1.1亚基自身就可在细胞膜上表达。无论细胞能量代谢状态如何,Ipt和Nat对单独表达的Kir6.1ΔC45和Kir1.1亚基通道都无直接作用,表明它们对SUR2B/Kir6.1产生激活效应的作用亚单位靶点应该在SUR2B亚基上。无论细胞能量代谢状态如何,Ipt和Nat对单独表达的Kir6.2ΔC36亚基通道都有一定的抑制作用,这种作用与药物对能量代谢抑制预激活的SUR/Kir6.2三种亚型KATP通道电流产生的抑制作用在药物的浓度依赖性和作用强度上都基本一致,表明它们对SUR/Kir6.2亚型KATP通道产生抑制作用的亚单位靶点应该在Kir6.2亚基上。二、埃他卡林激活SUR2B/Kir6.1通道受胞内能量物质调控的机制研究将SUR2B亚基NBDs上两个与胞内核苷酸结合和/或水解相关的重要氨基酸位点K707和K1348分别进行单点突变后,Ipt和Nat在正常的能量代谢状态时丧失对突变型SUR2B/Kir6.1通道电流的激活作用;在能量代谢抑制状态时可一定程度上激活通道电流,但此激活作用与野生型相比大大降低;将双位点都突变后,Ipt和Nat在正常能量代谢状态和能量代谢抑制状态时都不能激活通道电流。这表明药物对SUR2B/Kir6.1亚型KATP通道的激活作用与胞内能量物质(Mg ATP和Mg ADP)在SUR2B亚基上的结合/水解密切相关,核苷酸类能量物质可对药物在SUR2B亚基上的结合位点产生变构调节作用,从而将药物作用和细胞能量代谢状态联系起来。综上所述,本研究主要结论如下:1.当细胞能量代谢状态正常时(静息态),Ipt和Nat高选择性地激活SUR2B/Kir6.1亚型KATP通道;当细胞处于能量代谢抑制状态时,此激活效应显著增强。2.Ipt和Nat对单独表达的Kir6.1亚基(Kir6.1ΔC45)通道无直接作用,表明它们对SUR2B/Kir6.1亚型通道产生激活效应的作用亚单位靶点应该在SUR2B亚基上。3.细胞的能量代谢状态影响Ipt和Nat对SUR2B/Kir6.1亚型激活作用的分子机制与胞内能量物质在SUR2B亚基上的结合/水解密切相关,其中NBDs的WA上的两个重要氨基酸位点K707和K1348参与了此调控作用。4.在通道被能量代谢抑制(或与KCO联用)预激活时,Ipt和Nat对SUR/Kir6.2三种亚型KATP通道有一定的抑制作用,此作用与药物对单独表达的Kir6.2亚基(Kir6.2ΔC36)通道的抑制作用基本一致,表明它们对SUR/Kir6.2亚型KATP通道产生抑制作用的亚单位靶点应该在Kir6.2亚基上。总之,本研究在不同SUR/Kir6.x组合的六种亚型KATP通道的功能性表达模型上,应用电生理技术,系统地研究了新型KCO埃他卡林及其衍生物纳他卡林对不同亚型KATP通道的选择性作用特征并初步阐明了其作用的分子药理学机制。这为认识药物对KATP通道的亚型选择性、细胞能量代谢状态选择性及其作用的亚单位靶点提供了直接且全面的实验依据,并为探究胞内能量物质对药物作用调控的分子机制提供了研究线索。