海洋环境复杂多变,孕育了丰富多彩的自然资源。海洋微生物具有物种多样性、基因功能多样性及生态功能多样性等特点。近年来多种新型海洋微生物酶蛋白被开发利用。酯类水解酶可以催化羧基酯键水解与合成,在细菌胞内代谢中发挥重要作用,也被广泛应用于多种工业领域。OsmC是一类由渗透压诱导的硫醇依赖型过氧化物酶,参与细胞氧化应激防御反应。酯酶催化结构域可结合OsmC结构域,形成双结构域酯酶。研究含OsmC结构域的酯酶对于酯类水解酶以及多结构域酶的研究与开发意义重大。在本论文中,我们以含OsmC结构域的新型海洋酯酶为研究对象,在分析其生化特性的同时,研究OsmC结构域对于其酯酶催化结构域的影响,并通过蛋白晶体结构解析,初步阐明了 OsmC结构域影响其酯酶活性的结构基础。一、新型海洋酯酶Est22的生化性质分析及其OsmC结构域对酯酶活性的影响对海洋细菌Pseudoalteromonasluteoviolacea的基因组进行序列筛选,获得了一个编码含OsmC结构域的酯酶基因,Est22。在Escherichia coli BL21(DE3)中对Est22进行了异源表达和分离纯化,并对其基本酶学性质进行了表征。Est22能高效降解pNPC2-pNPC8,对pNPC4的降解能力最强。Est22不具有过氧化酶活性。Est22最适温度为30℃,在0℃仍可保留40%的酶活力,在超过40℃的温度条件下稳定性较差,为低温酶。最适反应pH为9。高浓度的NaCl(2 M)对于Est22具有显著的激活作用,且Est22在4 M NaCl中能稳定存在,表明Est22为耐盐酶。动力学参数比较分析发现,NaCl通过影响Est22的kcat而非Km来激活其酶活性。同时,通过比较分析Est22及其缺失突变体(Est22-258N)的生化性质,揭示OsmC结构域对其酯酶活性的影响。OsmC结构域的缺失,不影响Est22的底物特异性和最适pH。但是,缺失突变体的最适反应温度和热稳定性均降低,这表明OsmC结构域的存在,使Est22蛋白的结构更紧密,且在高温下具有更高的酶活性。二、新型海洋酯酶E45的生化性质分析及其OsmC结构域对酯酶活性的影响E45来源于海洋细菌Pseudoalteromonas aliena,是Est22的同源蛋白,二者间的序列相似性为59%。E45具有与Est22相似的底物选择性和最适反应温度。E45在高温中的稳定性要好于Est22。E45比Est22更嗜碱,其最适反应pH为10。类似于Est22,高浓度的NaCl同样对E45酶活性具有显著促进作用,E45对高盐的耐受性也较好。但是,不同于Est22,NaCl通过影响E45的Km与kcat来激活其酶活性,这种差异可能是由这两个酶在序列上的相似性相对不高造成的。同样,我们研究了 OsmC结构域对E45酯酶活性的影响,并与Est22进行了比较分析。OsmC结构域缺失后,E45的底物特异性和最适pH不受影响,这与Est22相一致。E45缺失突变体的热稳定性降低,但最适反应温度没有发生变化,这不同于Est22。此外,通过对E45的研究揭示出,OsmC结构域的缺失,基本不影响E45酯酶结构域在含盐和不含盐条件下的kcat和Km。NaCl对E45全酶酶活性的激活作用是通过影响E45的酯酶催化结构域而实现的。三、E45的晶体结构解析及分析以E45硒代衍生物的晶体结构作为E45的OsmC结构域模板,以已报道的EstRM结构作为E45的酯酶结构域模板,通过分子置换的方法,解析了 E45全酶的晶体结构,分辨率为2.19 A。E45在晶体和溶液中均形成二体。E45中,两个单体主要通过OsmC结构域间相互交叉排列而形成稳定的二体。E45的酯酶结构域呈典型的α/β水解酶折叠结构,在其β6-β7间“Lid”结构域的插入,可能影响了 E45的底物选择性。E45的催化三联体由Ser106、Asp196和His225残基组成。结构上,E45的OsmC结构域远离酯酶结构域的催化腔,因而OsmC结构域不影响E45的酯酶活性。通过比较结构分析发现,E45中OsmC结构域在二聚体形成方式以及潜在活性位点等方面均不同于已知的OsmC,这种差异可能导致了 E45不具有过氧化酶活性或者具有微弱的过氧化酶活性。此外,初步探讨了 OsmC结构域影响E45热稳定性的结构基础。我们对Est22及其同源蛋白E45的研究,丰富了对海洋酯类水解酶的认识。