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脓毒症是感染引起的系统性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),在儿童(特别是婴幼儿)中具有较高发病率及致死率,不但严重威胁儿童生命健康,也给社会和家庭带来沉重的经济负担。当前,临床缺乏针对脓毒症的特效药物,仅依靠抗生素和支持疗法进行治疗。随着细菌耐药问题日益严重,机会感染不断增多,近年来儿童脓毒症发病率呈上升趋势。因此,深入研究其发病机制及治疗策略尤为重要。脓毒症的发病机制极其复杂,至今尚未完全阐明。已有研究显示,在脓毒症早期,病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)与损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMP)共同刺激固有免疫细胞,诱导和放大炎症反应,形成“细胞因子风暴”,可导致脓毒症休克的发生。在后期,脓毒症患者适应性免疫往往受到严重抑制,发生“二次感染”的风险急剧增加。本文将围绕脓毒症早期和后期免疫紊乱机制及其治疗策略展开研究。第一部分儿童急性阑尾炎中髓样相关蛋白的表达特征及诊断价值研究目的:研究髓样相关蛋白(myeloid-related protein,MRP)8、MRP14、MRP8/14在急性阑尾炎(acute appendicitis,AA)儿童外周血中的表达特征,并分析其临床意义,以期进一步了解DAMP与儿童AA中组织损伤的关系。方法:选择2013年06月至2015年01月就诊于苏州大学附属儿童医院普外科诊断为AA且实施阑尾切除术的患儿共89例,收集外周血血浆,根据病理诊断结果分为单纯组和复杂组,复杂组又包括化脓组和坏疽组。同时选择52例腹股沟斜疝儿童外周血血浆作为对照组。分别检测各组血浆中MRP8、MRP14、MRP8/14、IL-6、TNF-a的水平,结合临床指标进行分析。结果:(1)AA组MRP8、MRP14、MRP8/14、IL-6的表达水平明显高于对照组(P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.001),TNF-a的表达水平在两组间无显著差异;(2)AA组MRP8和MRP8/14,MRP8和MRP14之间表达水平呈正相关(P<0.001,P<0.001),但MRP14与MRP8/14之间无相关性。MRP8/14与LDH之间表达水平呈正相关(P<0.05),与血小板数量呈负相关(P<0.001);(3)化脓组和坏疽组MRP8的水平均显著高于对照组(P<0.05,P<0.05),化脓组MRP14的水平也明显高于对照组(P<0.05),但MRP8/14的水平在三组间无明显差异;(4)诊断AA组和对照组时,ROC曲线下面积(area under ROC curve,AUC)从大到小依次为CRP(0.976),IL-6(0.947),MRP8(0.836),MRP14(0.823),MRP8/14(0.763)。诊断单纯组和复杂组时,AUC从大到小依次为CRP(0.809),MRP8(0.763),IL-6(0.756),MRP14(0.754),MRP8/14(0.635)。结论:MRP8、MRP14、MRP8/14在AA儿童中显著升高,其表达水平可能与组织损伤密切相关。此外,MRP8和MRP14在复杂性阑尾炎中表达高于单纯性阑尾炎,MRP8在儿童单纯性和复杂性阑尾炎鉴别诊断中具有重要价值。第二部分儿童脓毒症辅助性T细胞相关因子表达谱分析目的:研究脓毒症儿童辅助性T细胞(T helper lymphocyte,Th)相关因子表达谱特征,为临床个体化治疗提供实验依据。方法:选择2015年07月至2016年12月入住苏州大学附属儿童医院PICU脓毒症患儿53例,SIRS患儿13例,收集外周血血浆。同时,选择41例我院同期住院的腹股沟斜疝儿童作为对照组。采用流式细胞仪分别检测血浆中IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、TNF-a、IFN-γ的水平,并对脓毒症组和对照组,脓毒症组和SIRS组进行聚类分析。结果:(1)与对照组相比,脓毒症组明显下降的细胞因子有IFN-γ(P<0.001)、IL-2(P<0.001)、IL-4(P<0.001)、IL-5(P<0.01)、IL-13(P<0.05)、IL-17A(P<0.001)、IL-17F(P<0.001)、IL-9(P<0.01)、IL-21(P<0.001)、TNF-a(P<0.001),明显升高的有IL-10(P<0.05),IL-6和IL-22在两组间无统计学差异;(2)根据Th细胞相关因子表达水平将脓毒症组与对照组进行聚类分析,可将两组较好区分;(3)与SIRS组相比,脓毒症组表达明显下降的细胞因子有IL-4(P<0.05)、IL-5(P<0.05)、IL-17A(P<0.05)、IL-9(P<0.05),明显升高的有IL-10(P<0.05),其他细胞因子在两组间无统计学差异;(4)根据Th细胞相关因子表达水平将脓毒症组与SIRS组进行聚类分析,分群不明显。结论:Th细胞功能抑制及免疫状态异质性增加是脓毒症儿童的普遍特征,脓毒症患儿与SIRS患儿相比,Th细胞相关因子表达谱差异不明显,但IL-4、IL-5、IL-17A、IL-9、IL-10可能成为鉴别诊断指标。第三部分小分子药物C646调控巨噬细胞功能及其在脓毒症中疗效研究目的:研究小分子药物C646对巨噬细胞的调控作用及机制,并探讨其在脓毒症中的疗效。方法:采用流式细胞术和Real-time PCR检测C646对小鼠体内、体外炎症因子表达的影响;采用Western Blot技术检测细胞内信号通路的影响;采用流式细胞术检测C646对巨噬细胞LPS受体表达,LPS结合能力,吞噬受体表达,细菌摄取及吞噬能力的影响;采用荧光共聚焦显微镜观察C646对巨噬细胞吞噬体成熟的影响;体外杀菌实验检测C646对巨噬细胞杀菌能力的影响;构建小鼠内毒素休克模型,观察C646对脓毒症小鼠生存率及组织炎症损伤的影响。结果:(1)C646可以明显抑制巨噬细胞表达TNF-a、MCP-1、IL-6等炎症因子,也可抑制CD14和TLR4/MD2的表达,但对细胞结合LPS的能力无明显影响,C646还可以抑制JNK、ERK1/2、p65的磷酸化,对p38磷酸化无明显影响;(2)C646可以明显抑制巨噬细胞上FcγRIII/II和CR3的表达,对FcγRI的水平无明显影响,C646还可以明显抑制巨噬细胞摄取和吞噬E.coli的能力,也可以抑制吞噬体与溶酶体融合过程,并抑制巨噬细胞杀菌能力;(3)C646可以抑制内毒素休克小鼠TNF-a和IL-6的表达,但对其生存率无明显影响,也不能改善LPS引起的小鼠肺、肝组织炎症损伤。结论:C646可以抑制巨噬细胞介导的炎症反应,但不能改善内毒素休克小鼠的病情,这可能与C646抑制巨噬细胞吞噬及杀菌功能有关。