卒中在全球范围内是致死和致残的主要疾病之一。其中,缺血性脑卒中占所有脑卒中的87%,其高发病率、高复发率、高致残率严重威胁着人类的生活质量。缺血性卒中的基本病理改变是脑梗死。其发生机制是由于局部脑组织血流供应障碍,导致缺血区组织坏死。供血发生障碍后,缺血区域的组织有两种命运。其一是缺血核心区的组织因血流完全中断、能量耗竭,很快引起组织不可逆性损伤(缺血坏死)和相应脑功能的丧失；其二是缺血周围区,由于侧支循环的存在导致其供血部分存在,若在短时间内恢复血流,组织仍能被拯救,若血流不能恢复,则组织最终也发生不可逆性损害,这部分区域被称为缺血半暗带。对于缺血半暗带,葡萄糖和能量代谢障碍所引发的瀑布式级联反应和缺血再灌注后的病理变化是导致组织损伤的重要原因。在过去几十年中,神经科学界一直在探索急性卒中的治疗方法,在细胞研究和动物研究中发现了不少有效的方法,包括抗氧自由基、抗兴奋性氨基酸、神经保护、干细胞移植等,然而,绝大多数研究结果都无法转化到临床实践中。目前只有在相当窄的时间窗内给予组织纤溶酶原激活物(recombinant human tissue-type plasminogen activator, rtPA)溶栓这一治疗获得了充分的循证医学证据。溶栓治疗以药物溶解血栓,从而使闭塞的血管恢复再通。虽然溶栓治疗有确切的治疗效果,但因其治疗时间窗较窄,大部分患者难以在时窗内抵达医院而错失了治疗时机,另外,静脉溶栓也有一定的出血风险,这些不足限制了其在临床上的广泛开展。神经营养素家族在神经再生和重塑方面发挥着重要作用,主要包括神经生长因子(nerve growth factor, NGF)、脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)、神经营养素3(neurotrophin-3, NT-3)、神经营养素4/5(neurotrophin-4/5, NT4/5)、神经营养素6(neurotrophin-6, NT-6)和神经营养素7(neurotrophin-7, NT-7)。研究发现,这些可溶性多肽因子能抑制神经元凋亡,促进神经元存活、再生、塑形和与神经相关酶的合成。BDNF是脑内最重要的神经营养因子之一,具有维持、调控以及促进神经细胞生长的作用,能对各类神经细胞发挥作用。BDNF分布于脑内广泛区域,在外周组织中也有一定分布。动物实验证实,BDNF可降低缺血性卒中后局部脑组织缺血的程度,促进神经功能恢复,减轻神经功能缺损程度。这些作用与BDNF促进神经分化、神经再生和神经重塑等作用有关。但目前BDNF的这些作用只限于细胞和动物研究中,并未在临床实践中获得明确疗效。早期生长反应因子(early growth response 1, EGR1)也被称为神经生长因子可诱导因子(nerve growth factor inducible factor, NGFI-A)、Zif268、Krox-24及Tis8。EGR1具有三个高度保守的锌指结构,能够与靶基因DNA序列中富含GC的区域结合。目前认为与EGR1结合的DNA序列是G(C/A)GGGGG(C/A)GGGG。EGR1属于立早基因家族(immediate early genes, IEGs)中的一员,该家族基因的共同特点是在受到一系列外界刺激后能迅速短时间激活。EGR1受多种上游分子的调控并结合到下游分子启动子区域的特定序列,当受到某种刺激因子作用后可快速诱导和表达并通过其下游分子发挥功能。EGR1在正常体细胞中几乎不表达或者表达量很低,当细胞受到多种细胞外信号刺激时,机体可通过一个或多个信号转导通路激活EGR1的转录。活化的EGRl与靶基因启动子上特异的结合位点结合后,可调节细胞功能,发挥各种生物学效应。缺血缺氧作为外源性刺激,可诱导细胞快速过表达EGRl。作为重要的核转录因子,EGR1在调控细胞生长、分化、发育、增殖、炎性反应等方面都发挥着重要作用,尤其在炎性反应当中,可启动和放大炎症反应。在缺血性脑卒中后的脑组织中,过表达的EGR1所诱导的卒中后炎性反应,可能使缺血脑组织遭受二次损伤。目的作为神经营养素家族中至关重要的一员,BDNF具有潜在神经保护作用,但始终止步于动物实验,在临床研究中并未得到预期效果。同时,EGR1作为立早基因家族中的一员,其过量表达对缺血性卒中的预后有着不良效应。使用siRNA技术降低血管内皮细胞内的EGR1水平,可发挥缺血细胞的保护作用。通过生物信息学检索,我们发现在BDNF启动子上游含有EGR1的结合序列。因此,我们推测,EGR1有可能通过与BDNF启动子保守区域结合,降低BDNF的表达,从而影响缺血性卒中的预后。本研究旨在证明EGR1通过调节BDNF的表达,负面影响了缺血性卒中的预后。方法本实验包括在体和离体两部分。在体实验部分,选取的动物是由南京大学模式动物研究所提供的健康雄性SPF级、7-8周龄C57BL/6小鼠。为准确模拟缺血性卒中,对部分实验动物进行了线栓法大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型手术。为了探讨EGR1是否通过调节BDNF的表达而影响卒中的预后,分别构建了过表达EGR1(LV-EGR1)、沉默EGR1 (LV-shEGR1)以及空载对照(LV-control)的慢病毒,经、Vesternblot验证后再应用于动物在体研究。在体实验中,小鼠共分为5组：假手术(Sham+DMEM)组、空白对照(MCAO+DMEM)组、空载对照(MCAO+LV-control)组、过表达(MCAO+LV-EGR1)组、沉默(MCAO+shEGR1)组,其中DMEM是慢病毒的溶剂。除了假手术组,其它组的小鼠都进行了MCAO模型手术,术前6d侧脑室分别注射溶剂DMEM、慢病毒LV-control、LV-EGR1和]V-shEGR1,而Sham组小鼠进行造模手术,但线栓未堵住大脑中动脉开口处。给药后24 h取脑组织进行分析。离体实验部分获取16-17 d C57BL/6胎鼠大脑皮层,以原代培养神经元细胞,待培养至第5d左右用于实验。为模拟缺血缺氧状态,同一批培养的神经元细胞中部分予以适当时间糖氧剥夺(oxygen glucose deprivation, OGD)。培养的细胞同样分为5组：Sham组、空白对照(OGD+DMEM)组、空载对照(OGD+LV-control)组、过表达(OGD+LV-EGR1)组、沉默(OGD+shEGR1)组。给需要进行OGD的神经元2 h的OGD和24 h的再灌注损伤,各组间分别给予溶剂DMEM、慢病毒LV-control、LV-EGR1和]V-shEGR1后48h再予进行OGD处理。为了验证慢病毒构建是否成功,用Western Blot的方法分别检测了293T细胞、神经元细胞和脑组织中给予慢病毒72 h、72 h、7 d后EGR1表达的变化。为明确EGR1对缺血性卒中预后的影响,我们用氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)染色法来评估梗死体积,采用Fluoro-Jade C(FJC)染色法检测变性神经元,采用原位末端标记(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)法检测凋亡细胞。为了探究EGR1影响缺血性卒中预后的可能机制,我们采用Western blot检测了在体和离体缺血缺氧模型建立后以及给予各类慢病毒后EGR1和BDNF的表达水平。此外,还用免疫荧光共染的方式检测了脑组织中和体外培养神经元细胞中同一个细胞内EGR1和BDNF的表达情况。最后,为了探索EGR1是否通过作用于BDNF启动子而影响其表达,我们运用了电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)和染色质免疫沉淀技术(chtromatin immunoprecipitation, ChIP)分析了两者的结合情况。结果Western blot研究表明,在未给予慢病毒进行干预的情况下,缺血缺氧后EGR1和BDNF的表达水平明显上升,并于24h达高峰,直到48h仍处于较高状态,但较24h显著下降。在验证慢病毒构建有效性的时发现,给予过表达的EGR1慢病毒后,EGR1在293T细胞、神经元细胞和脑组织中的表达水平较空白对照组(*P<0.05)和空载病毒组(#P<0.05)显著升高,而给予沉默EGR1的慢病毒后其表达水平则处于明显下调状态。这一结果表明我们成功构建了过表达和沉默EGR1慢病毒。针对神经元细胞和脑组织的Western blot研究均表明,在过表达EGR1后,BDNF水平有所下降,而沉默EGR1后,BDNF表达水平明显上升。TTC染色法发现,在给予过表达EGR1慢病毒后梗死体积较空白对照组明显增加(过表达组vs.空白对照组：26.93±3.98%vs.20.61±2.38%,P<0.05),与空载对照组相比也有所增加(过表达组vs.空载对照组：26.93±3.98%vs.21.13±1.39%,P<0.05)；而在给予了沉默EGR1的慢病毒后梗死体积较空白对照组明显减少(过表达组vs.空白对照组：13.54±3.43%vs.20.61±2.38%,P<0.05),与LV-control组相比同样也减少(过表达组vs.空载对照组：13.54±3.43%vs.21.13±1.39%,P<0.05)。FJC染色和TUNEL染色表明,在过表达组有更多的FJC阳性细胞和TUNEL阳性细胞,而沉默组、空白对照与空载对照相比FJC阳性细胞和TUNEL阳性细胞明显减少。Western blot和免疫荧光共染的结果表明,缺血缺氧后EGR1和BDNF表达升高,过表达组EGR1的表达水平较空白对照组(*P<0.05)和空载病毒组(#P<0.05)显著升高,而BDNF的表达水平则恰好相反,与空白对照组(’P<0.05)和空载病毒组(#p<0.05)相比明显降低。反之,在沉默组,EGR1水平明显下降,而BDNF的水平刚处于上调状态。最后,EMSA实验表明,核蛋白产物可以和BDNF启动子结合,EGR1特异性抗体加入后出现超迁移带提示与BDNF启动子结合的蛋白确实是EGR1蛋白。同时ChIP实验结果也表明,EGR1可以结合于BDNF启动子上。结论脑组织缺血缺氧后,EGR1和BDNF的表达水平均明显升高。过表达的EGR1通过抑制BDNF的表达从而阻碍缺血性卒中的恢复。抑制EGR1的表达可能成为缺血卒中的一个潜在治疗方法。