论文部分内容阅读
糖不仅是细胞结构的重要组成部分和细胞代谢的主要能源物质，还可以作为一类功能性基团对一些生物分子进行修饰，影响这些生物分子的化学性质和生物学功能。糖基化修饰是植物次级代谢过程中的主要后修饰之一，能够改变次级代谢物的水溶性、亚细胞定位和生物活性。糖基化修饰也是研究较为深入的蛋白翻译后修饰之一，在蛋白折叠、质量控制、分泌及活性维持过程中扮演了重要的角色。本文围绕三萜化合物和蛋白的糖基化修饰开展研究:解析三萜化合物原人参三醇型人参皂苷合成途径中的糖基化修饰步骤;研究N-糖基化修饰对β-葡萄糖苷酶BglS折叠、分泌和酶学性质的影响。 人参皂苷是人参中的主要活性物质。绝大多数人参皂苷是达玛烷型三萜皂苷元原人参二醇(protopanaxadiol，PPD)和原人参三醇(protopanaxatriol，PPT)经过不同程度和类型的糖基化修饰后的产物。PPD和PPT的合成途径已经解析清楚，而后续步骤涉及到的UDP-糖基转移酶(UDP-glycosyltransferase，UGT)还没有报道。本实验室前期克隆并鉴定了1个UGT，UGTPg1，能够位点特异性地催化PPD及PPD型皂苷Rh2和Rg3的C20-OH糖基化修饰分别生成人参皂苷Compound K(CK)，F2和Rd。本研究证实了UGTPg1还能够区域特异性地催化PPT的C20-OH糖基化修饰生成人参皂苷F1。在克隆UGTPg1编码基因的过程中，我们还获得了四个与UGTPg1氨基酸序列一致性非常高(＞84％)的UGT编码基因。其中，UGTPg100能够催化PPT和F1的C6-OH糖基化修饰分别生成Rh1和Rg1。UGTPg101先催化PPT的C20-OH糖基化生成F1，再对F1的C6-OH进行糖基化生成Rg1。而UGTPg102和UGTPg103没有检测到酶活性。 通过蛋白同源建模和氨基酸定点突变，我们揭示了影响UGTPg1和UGTPg100催化活性和底物区域特异性的部分氨基酸位点。UGTPg1的H144位点氨基酸的替换改变了其催化功能:突变蛋白UGTPg1-H144F能够同时催化C20-OH和C6-OH的糖基化修饰，而UGTPg1-H144Y却没有酶活性。突变蛋白UGTPg1-H82C以及UGTPg1和UGTPg100的嵌合体蛋白Chi_6能够同时催化PPT的C20-OH和C6-OH糖基化生成F1和Rh1。A142，L186和R338对UGTPg100的催化活性至关重要，并且R338/339在UGT71亚家族中是非常保守的。 此外，我们还构建了能够合成人参皂苷F1或Rh1的酿酒酵母细胞工厂。通过对转化子的筛选，ZW-F1-17和ZW-Rh1-20合成F1和Rh1的产量最高，分别为42.1 mg/L和92.8 mg/L。不同于PPD型人参皂苷CK，绝大部分PPT型人参皂苷F1和Rh1都会被酵母细胞分泌到发酵液中，这可能是由于PPT上额外的一个羟基增强了相应皂苷的水溶性。 糖基化修饰也是蛋白翻译后修饰的主要类型之一。我们将士曲霉来源的一个β-葡萄糖苷酶BglS，分别在里氏木霉和巴氏毕赤酵母两个真核宿主中进行异源表达。在巴氏毕赤酵母中，BglS的四个预测的N-糖基化修饰位点都被高甘露糖型糖链修饰;而在里氏木霉中，仅N224位点被高甘露糖型糖链修饰，其他三个位点的N-糖链只有一个N-乙酰葡萄糖胺。在巴氏毕赤酵母中表达的BglS被过度糖基化修饰，其酶活力、热稳定性以及与底物的亲和力都相对较低。而里氏木霉中适度的翻译后和分泌后N-糖基化修饰使其成为异源表达BglS的具有优势的宿主。另外，我们还发现每一条N-糖链对BglS的催化活性和热稳定性都有贡献，但N224位点的糖链很可能参与了BglS的正确折叠。 综上所述，本研究克隆并鉴定了3个参与PPT型人参皂苷合成的UGTs，解析了人参皂苷的合成途径中的部分糖基化修饰步骤。通过构建合成人参皂苷F1和Rh1的酿酒酵母细胞工厂，为稀有人参皂苷的大规模生产提供了具有潜力的方法。这些UGTs蛋白同源建模和定点突变的研究结果有助于我们更好的认识UGT71亚家族UGTs与催化活性和底物区域特异性相关的氨基酸位点。对BglS的糖基化修饰研究提示我们里氏木霉是具有适度糖基化修饰系统的真核表达宿主，并且N224位点糖链重要功能的揭示有助于我们对β-葡萄糖苷酶进行设计和改造，以提高其分泌量和催化活性。