三株大型真菌的发酵条件优化及其胞外多糖的结构与功能研究

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关于真菌多糖的研究方兴未艾,部分珍稀的野生大型真菌不断有相关研究与报道,银杏多孔菌(Fomitopsis sp.)、小孔硬孔菌[Rigidoporus microporus(Fr.)Overh.]、大肉齿耳菌(Steccherinum septentrionale(Fr.)Bank.)三株野生大型真菌,在液体发酵及胞外多糖结构与功能研究方面,尚未有相关报道。本课题以这三株大型真菌为研究对象,在分子生物学水平上对采集于长白山山脉的银杏多孔菌进行了菌株鉴定,并对三株真菌进行了摇瓶与液体深层发酵实验,通过液体深层发酵培养,收集了胞外粗多糖,纯化处理得到精制多糖,通过傅里叶红外变换、气相色谱、热重、刚果红及特异性粘度实验等检测手段,预测了多糖分子的结构与组成,通过DPPH法、邻二氮菲法进行了胞外多糖抗氧化实验。结果如下:  1、种属鉴定  采用ITS技术,对银杏多孔菌进行分子生物学鉴定。将获得的ITS基因序列提交至NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),获得基因序列号:KF279536。通过对包含银杏多孔菌在内的这些ITS序列进行初步比对,并构建系统发育树,结果证实该大型真菌属于拟层孔菌属。  2、液体深层发酵实验  摇瓶发酵,确定了三株大型真菌最优发酵条件,银杏多孔菌(Ginkgo polypores):周期8d,乳糖、酵母浸粉分别作为C源、N源;小孔硬孔菌[Rigidoporus microporus(Fr.)Overh.]:周期6d、C源为乳糖、N源为胰蛋白胨;大肉齿耳菌(Steccherinum septentrionale(Fr.)Bank.):周期8d、麦芽糖与大豆粉分别为C、N源。在此基础上,通过5L三联罐液体深层发酵实验,初步探索了三株大型真菌在液体发酵条件下胞外多糖与菌丝干重、显微形态特征及流变学特性,结果发现菌丝球形态学与流变学存在相互影响、相互制约的关系。  3、胞外多糖的纯化、结构与功能研究  通过过滤、醇沉收集胞外粗多糖,再经Sevage法除蛋白、Sepharose CL-6B凝胶柱层析,获得精多糖。(1)红外分析表明,除了典型的多糖吸收峰外,银杏多孔菌胞外多糖存在吡喃环和羧酸基团;小孔硬孔菌胞外多糖存在α和β糖苷键;大肉齿耳菌存在β-葡萄糖醛酸及甘露糖结构。(2)气相分析表明,银杏多孔菌胞外多糖主要由吡喃甘露糖(59.32%)、吡喃半乳糖(12.71%)和葡萄糖(11.02%)组成;小孔硬孔菌单糖组成为葡萄糖(50.09%)、甘露糖(28.53%)和半乳糖(15.83%);大肉齿耳菌胞外多糖主要由葡萄糖组成,占比98.05%。(3)通过热重分析实验可知,三株大型真菌胞外多糖在低于101℃、112.11℃和132.49℃的温度下,能较好的保持生物学活性。(4)刚果红实验,小孔硬孔菌胞外多糖可以与刚果红形成络合物,证明其高级结构中存在三股螺旋的无规线团链构象,而银杏多孔菌与大肉齿耳菌胞外多糖不存在这一结构。(5)乌氏粘度计测定胞外多糖的特异性粘度,发现银杏多孔菌、小孔硬孔菌及大肉齿耳菌胞外多糖的特异性粘度分别为274mL/g、334mL/g及543mL/g。(6)体外抗氧化实验表明,三种大型真菌胞外多糖都有一定的抗氧化活性,但差异也较显著,银杏多孔菌胞外多糖对DPPH清除率较低,多糖浓度为2.5mg/mL时,DPPH清除率为10.02%,但对·OH自由基清除率较高,在4mg/mL时·OH自由基清除率达到37.99%;小孔硬孔菌对DPPH与·OH自由基清除率均较低,分别为8.75%和4.37%;大肉齿耳菌胞外多糖对DPPH、·OH自由基清除率相对都较高,在多糖浓度为3mg/mL时,对DPPH、·OH自由基的清除率达到24.43%、47.45%。  通过以上实验,我们了解到银杏多孔菌在真菌分类学上的地位,明确了三株大型真菌在液体深层发酵过程的形态学、流变学变化,并初步探讨了胞外多糖的构效关系,这为大型真菌可能的工业化进程奠定了重要的理论基础。
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