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背景 端粒酶是一种RNA依赖性DNA聚合酶，它的作用是在线性染色体的末端添加TTAGGG重复片段。正常人体细胞中很少检出端粒酶活性，而肿瘤细胞可异常高表达端粒酶活性。端粒酶激活可以维持增殖细胞染色体的稳定性，导致细胞永生化和肿瘤发生。人端粒酶包括三个部分：即人端粒酶RNA，端粒酶相关蛋白TP1，和人端粒酶催化亚单位hTERT。端粒酶在恶性肿瘤的进展中起着重要作用，是恶性肿瘤诊断的标记物和新靶点。端粒酶活性调控的机制十分复杂，目前发现与端粒酶的结构，细胞周期和细胞分化，凋亡基因等因素有关。近年来研究表明，原癌基因C-myc对hTERT基因的调控可能是激活端粒酶，诱发肿瘤的重要途径。冬凌草甲素（Oridonin，ORI）是从中草药冬凌草中提取的一种四环二萜类化合物，体内外实验证明其有较强的抗癌作用，临床上曾用于食管癌和肝癌的治疗，取得了一定疗效，是一种很有前景的抗癌新药。以前研究发现ORI可以抑制DNA的合成，同时具有G2-M期阻滞作用。近年来报道它可诱导K562，HL60，Hela细胞凋亡。但对其抗癌分子机制和端粒酶活性关系的研究未见报道。本研究运用细胞生物学和分子生物学技术，观察了ORI对K562细胞端粒酶活性的影响，并对其下调端粒酶活性的机制进行了探讨，为ORI进一步临床应用提供了新的理论依据。郑州人学2004届倾卜学位论文冬凌草甲素对K562细胞端粒酶活性和细胞周期的的影响方法实验选择人红白血病细胞株K562，采用MTT（3一（4，5一dimethylthiaZol）一2，5一diphenylte一ZH一tetrazolium bromide，MTT）分析法，测定不同浓度oRI单用及与阿霉素（Adiamycin，ADR）合用对K562细胞的直接细胞毒作用;采用免疫组织化学（immunohistoehemist翔，IHC）法测定K562细胞内hTERT和C一MYC蛋白的表达:采用端粒重复序列扩增法（TRAP）酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测了端粒酶的活性变化;采用流式细胞仪测定细胞周期各时相百分比。今古甲二月71又 1.ORI对K562细胞的细胞毒作用 MTT结果显示ORI对K562细胞的生长有明显的抑制作用，各实验组与正常对照组OD值的差异有统计学意义（尸<0 .05），且在一定的浓度范围内存在剂量依赖性。其Ieso值为6.39士0.29件mol.L一’。 2.0咫和ADR对K562细胞的联合细胞毒作用 oRI、ADR单用组对K562细胞的细胞毒作用较弱，其结果为:6.86林mol.u‘ORI的抑制率为（53.06士1.53）o，o，13.72林mox.L一’oRI的抑制率为（65.90士0.93）o’0，0.34林mol.L一’AoR的抑制率为（44.50士0.82）%，0.34林mol.L’IADR与6.56林mol.L‘’oRI合用的抑制率为（67.19士l，72）o，o，与单用0.34林mol，L一’ADR和单用6.56林mol.L“’oRI相比，差异有统计学意义（尸<0.01）。0.34林mol.L一’AoR与 13.72林mol.L一’oRI合用的抑制率为（90.92士1 .29）%，与单用o.34omol.L一’AnR和单用13.72、mol.L“’oRI相比，差异有统计学意义（尸<0.01）。 3.ORI对K562细胞hTERI，和C一MYC表达的影响 采用IHC法检测hTERT和C一MYC的表达，Hl队S一1000高清晰度彩色病理图文分析系统进行分析，以细胞的积分光密度值作为量化指标。hTERT对照组的积分光密度值为8.80士2.64，用3.43林mol.L一’oRI处理48h后，积分光密度值为3.17士1.45，实验组与对照组相比，hTERT的蛋白表达的差异有统计学意义（尸<0 .01）。C一MYC对照组的积分光密度值为7.48土1 .74，用3.43林mol.L一’oRI处理48h后，积分光密度值为2.28士0.92，实验组与对照组相比，C一MYC蛋白表达的差异有统计学意义郑州大学2004届硕士学位论文冬凌草甲素对K562细胞端粒酶活性和细胞周期的的影响 (P（0 .01）。 4.ORI对562细胞端粒酶活性的影响 采用TRAP一PCR一ELISA法检测端粒酶活性，以波长450nln和630rlln处的吸光度差值△A代表端粒酶活性。阳性对照组△A为1.08士0.04，阴性对照组△A为0.06士0.01。用6.86卜mol.L一’、3.43协mol.L一，oRx处理k562细胞24h后，△A分别为】.18士0.12、1 .16士0.05;2呜h空白对照组△A为1 .20士0.12，各实验组和空白对照组相比差异无统计学意义（尸>0.05）。用6.56脚ol.L一’、3.43娜ox.L一’oRI处理k562细胞48h后，△A分别为0.94士0.08、0.19士0.03:48h空白对照组△A为1.17士0.10洛实验组和空白对照组相比差异有统计学意义（尸<0 .01）。 5.ORI对K562细胞细胞周期的影响 将不同浓度的ORI加入体外培养的K562细胞中，流式细胞仪检测细胞周期百分比，结果显示:培养24h后，空白对照组、3 .43协mol.L一’o犯、6.56协mol.L一‘oRI、13.72抖mox.L一’oRx的s期细胞百分比率分别为41.96%、39.740，0、34.490，0、32.040，0，各实验组和空白对照组相比，差异有统计学意义（尸<0.05）。培养48h后，空白对照组、3.43;mol.L一’oRI、6.56娜ol.L一’o咫、13.72娜ol.L一’oRI的s期细胞百分比率分别为46.39%、28.08%、30.92%、29.10%，各实验组和空白对照组相比，差异有统计学意义（P<0 .05）。结论在一定的浓度范围内（3 .43娜ol.L’，一6.86协mol.L一，），oRI可下调K562细胞的端粒酶活性。2.ORI下调K562细胞的端粒酶活性可能与