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病毒性心肌炎(viral myocarditis, VMC)是一种病毒感染引起的急性心肌局灶性或弥漫性病变，是临床常见的心血管疾病之一。众多研究已经证实，嗜心性病毒如柯萨奇病毒B3（coxsackievirus B3，CVB3）感染不但可以引起VMC，部分VMC患者可转化为扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)，两者是心源性猝死的重要原因。目前认为，病毒的直接攻击和其引发的自身免疫反应在VMC的发病机制中起到重要作用。临床研究及动物实验表明，T辅助细胞（Th）如Th1、Th2、Th17细胞及其效应因子如IFN-γ、IL-12、IL-10、IL-17等在调节VMC免疫及炎症网络方面起重要的作用。然而，VMC发病机制仍未完全阐明，目前临床上针对VMC仍以对症支持治疗为主，因此进一步研究病毒性心肌炎的发病机制有重要意义。Th22细胞是以分泌白介素-22(interleukin-22，IL-22)为特征的一种新发现的独立CD4+T辅助细胞亚群，其不同于传统的Th1、Th2、Th17等细胞亚群。近来研究表明，Th22细胞及其效应因子IL-22参与人或动物多种自身免疫性疾病及感染性疾病的病理生理机制,且其特征性细胞因子IL-22在呼吸道损伤和炎症中促进/抑制炎症的功能由IL-17A调节。然而Th22细胞及其效应因子IL-22是否参与病毒性心肌炎发病过程？在VMC中促进还是抑制心肌炎症发展？IL-l7A是否影响其作用？目前尚未报道。为深入了解Th22细胞及IL-22是否参与VMC发病机制，阐明其在VMC中的作用，寻求VMC新的治疗思路和靶点，本课题拟应用BALB/c小鼠腹腔注射CVB3方法建立VMC模型，进行以下三方面研究。第一部分VMC小鼠Th22细胞及其相关因子的表达本部分包括两个方面的研究：1、小鼠VMC模型的建立以及心肌病理组织学改变；2、小鼠VMC Th22细胞亚群及其相关因子IL-22、IL-22受体（IL-22R）的变化及意义。32只6周龄雄性BALB/c小鼠随机分为VMC组(n=20)及对照组(n=12)。采用腹腔接种CVB3建立VMC模型（VMC组），对照组腹腔注射等量的磷酸盐缓冲液（PBS），各组小鼠在规定时点取血，分离血浆，无菌取心脏和脾。HE染色了解心肌病理组织学改变并计算心肌病理积分；流式细胞术（FACS）检测小鼠脾Th22细胞；实时荧光定量PCR(realtime RT-PCR)检测心肌组织Th22细胞相关因子IL-22、IL-22R1（IL-22特异性受体亚基）、IL-10R2mRNA的表达；免疫组织化学检测小鼠心肌组织IL-22表达水平；酶联免疫双夹心抗体法（ELISA）检测血浆中IL-22蛋白的表达。病理结果显示，VMC组小鼠心肌组织病理积分明显升高，与对照组相应时点亚组比较差异有显著性（P<0.05）。流式细胞计数结果显示，对照组Th22细胞表达量为0.84%±0.33%，VMC组明显升高（3.47%±0.66%），差异有统计学意义（P<0.01）。免疫组化结果显示，VMC组心肌组织IL-22较对照组明显升高（236.24±43.26vs.17.45±5.21，P<0.01）。RT-PCR结果显示VMC组心肌组织IL-22、IL-22R1mRNA均较对照组明显升高（21.28±4.28vs.4.28±0.97；3.01±0.78vs.1.05±0.29, P均<0.01）。VMC组心肌组织IL-10R2mRNA较对照组明显降低（43.28±9.14vs.58.5±9.01,P<0.05）。ELISA结果显示，VMC组血浆IL-22蛋白含量较对照组明显升高（20.21±3.81vs.3.02±0.83pg/ml, P<0.01）。结论：Th22细胞及其相关因子IL-22、IL-22R1在VMC组均较对照组增高，提示Th22细胞及其相关因子可能参与小鼠VMC的发病机制。第二部分：抗IL-22抗体对小鼠VMC的干预作用本部分包括三个方面的研究：1、抗IL-22抗体对VMC小鼠心肌病理改变的影响；2、抗IL-22抗体对VMC小鼠IL-22--IL-22R表达的影响；3、抗IL-22抗体对VMC小鼠IL-6、TNF-α、IL-17、IFN-γ、IL-1β表达以及病毒复制的影响。6周龄雄性BABL/c小鼠36只，随机分成3组，抗IL-22抗体组（Anti-IL-22Ab组，n=12）、同型对照组（IgG组，n=12）、PBS组（n=12）。Anti-IL-22Ab、IgG和PBS组小鼠均腹腔注射CVB3病毒液，注射病毒当天定义为第0天。Anti-IL-22Ab、IgG和PBS组小鼠在第0天分别腹腔注射50μg Anti-IL-22Ab、50μg同型对照IgG和50μg PBS。HE染色了解心肌病理改变；RT-PCR检测小鼠心肌组织中IL-22、IL-22R1、IL-10R2、IL-17、TNF-α、CVB3、IL-6、IFN-γ、IL-1βmRNA的表达；ELISA检测小鼠血浆中IL-22、IL-17、TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-1β的表达水平；流式细胞技术检测脾Th22亚群细胞数目；空斑形成法检测心肌病毒滴度。结果显示，Anti-IL-22Ab可增加心脏重量/体重（HW/BW）比值、增多心肌组织内炎性浸润灶、升高心肌病理积分。Anti-IL-22Ab减少Th22细胞及IL-22水平，增加心肌中IL-22R1的含量，升高心肌及血浆中IL-17、IL-6、TNF-α、降低IFN-γ的mRNA及蛋白水平，促进心肌病毒复制。对IL-1β的mRNA及蛋白表达均无明显影响。结论：Th22细胞的重要细胞因子IL-22减少VMC小鼠心肌炎症、抑制病毒复制，发挥保护心肌的重要作用。IL-22可能是治疗VMC的重要靶标。第三部分IL-17A对小鼠病毒性心肌炎中IL-22作用的影响本部分包括两个方面的研究：1.抗IL-22抗体对IL-17A-/-小鼠病毒性心肌炎心肌病理变化的影响；2.抗IL-22抗体对IL-17A-/-小鼠病毒性心肌炎心肌病毒复制，IL-6、TNF-α、IFN-γ及STAT3表达的影响。6周龄SPF级雄性IL-17A基因敲除型(IL-17A-deficient,IL-17A-/-) BALB/c小鼠32只，随机分成4组，抗IL-22抗体组（Anti-IL-22Ab组，n=8）、同型对照组（IgG组，n=8）、病毒性心肌炎组（VMC组，n=8）、正常对照组（Normal组，n=8）。 Anti-IL-22Ab、IgG和VMC组小鼠均腹腔注射CVB3病毒液，注射病毒当天定义为第0天。Anti-IL-22Ab、IgG和VMC组小鼠在第0天分别腹腔注射50μgAnti-IL-22Ab、50μg同型对照IgG和50μg PBS。正常对照组（Normal组）未接受任何处理。第14天时，所有小鼠摘眼球取血后处死小鼠。HE染色了解心肌病理改变；记录心脏重量/体重（HW/BW）比值；RT-PCR法测定心肌组织CVB3、TNF-α、IL-6、IFN-γ、STAT3、IL-22的mRNA含量；ELISA检测小鼠血清中IL-22浓度；空斑形成法评估心肌病毒滴度；蛋白质印迹（Western-blot）法检测小鼠心肌组织磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白表达；重组IL-17（rIL-17）培养VMC小鼠脾脏淋巴细胞，RT-PCR法检测淋巴细胞IL-22及IL-6mRNA，ELISA法观察培养上清液IL-22蛋白浓度。结果显示：在IL-17A基因敲除背景下，Anti-IL-22Ab降低VMC的严重程度，降低VMC的HW/BW，加重心肌CVB3病毒复制，减少心肌炎性因子TNF-ɑ、IL-6、IFN-γ mRNA含量，降低STAT3mRNA及p-STAT3蛋白表达，降低心肌IL-22mRNA及血清IL-22蛋白水平，且心肌CVB3RNA与IL-22mRNA、CVB3RNA与IFN-γ mRNA均呈负相关。同时，体外细胞培养实验证明，重组IL-17（rIL-17）促进VMC小鼠脾脏淋巴细胞合成分泌IL-22及IL-6。结论：在IL-17A基因敲除背景下，IL-22加重心肌炎症，抑制心肌病毒复制。结合第二部分研究内容，提示IL-17A能调节IL-22对VMC心肌组织炎症抑制/促进的功效，但不改变IL-22抑制心肌病毒复制的作用。本课题研究结果提示：VMC小鼠中Th22细胞及其效应因子IL-22、IL-22特异性受体亚基IL-22R1均明显升高，提示Th22细胞及其细胞因子可能参与VMC发病机制；在IL-17A共表达情况下，IL-22降低VMC小鼠心肌组织炎症程度，其作用机制可能主要与抑制病毒复制，抑制炎性因子IL-6、IL-17及TNF-α的水平，促进病毒清除者IFN-γ含量上升有关；在缺乏IL-17A的背景下，IL-22虽仍能抑制病毒复制，但加重VMC心肌炎症，其机制可能与促进炎性因子TNF-ɑ、IL-6、IFN-γ的表达有关，提示在VMC小鼠中，IL-17A不能调节IL-22的抗病毒功效，但可调节IL-22的促炎/抑炎作用。这些数据提示Th22细胞可能参与VMC的发病机制，Th22细胞及其细胞因子IL-22可能将成为病毒性心肌炎新的治疗靶点。