肝细胞癌是世界发病率第六和致死性第二大的癌症。肝细胞癌对放化疗耐受性缘于自身具有较强的抗凋亡和再生功能。多种细胞信号通路及错综复杂的信号网络参与肝细胞癌的形成和恶化进程,这些信号通路包括NF-κB,p53基因突变,JAK-STAT,以及Raf/MAPK/ERK等。发现新的潜在的特异性靶点以及阻断其抗凋亡通路可作为发展肝癌治疗手段更有效的方法。作为含量最丰富的内质网分子伴侣,热休克蛋白gp96主要参与新生蛋白多肽的折叠加工和辅助蛋白复合体成熟并分泌到细胞膜外。但大量的临床检测表明热休克gp96在肝肿瘤中过量表达,并且与肿瘤的表型和病情恶化的程度呈显著相关性。本研究试图去探索gp96在肝癌细胞增殖和凋亡过程的作用,并分析其中的具体调控机制。通过体内和体外试验评估gp96能否作为一个潜在的肝癌治疗靶点。通过RNAi技术构建两株热休克蛋白gp96稳定敲低表达的肝癌细胞株SK-Hep-l-gp96 KD和HepG2-gp96 KD, CCK-8实验以及流式细胞仪分别检测gp96表达干扰后对肿瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响,实验分析发现gp96敲低后能显著下调细胞的生长,引起细胞周期阻滞,更值得注意的是gp96的缺失能显著促进细胞的凋亡以及对化疗药物的敏感性,表明热休克蛋白gp96在细胞周期,细胞增殖以及凋亡中起到的关键的调控作用。此外,通过细胞凋亡功能蛋白质组学分析发现p53在gp96介导的细胞凋亡过程中扮演关键角色。过表达和敲低表达分析均证明gp96能够抑制p53的蛋白水平,并且gp96对p53的调节是发生在其翻译后水平上,因为在gp96干扰后并没有发现p53 mRNA的显著变化。随后我们利用P53缺失型和野生型的结肠癌细胞系HCT116 p53 wild-type (+/+)和HCT116 p53 null(-/-)研究p53在gp96介导的细胞凋亡和周期调控中的作用,结果显示在p53缺失的细胞中,gp96对p53及其下游分子p21、caspase-3以及对细胞凋亡和周期的影响很大程度上减弱了,表明gp96对肝癌细胞的凋亡调控是依赖p53的功能。Co-IP和GST pull down分析进一步发现gp96可以与p53以及p53蛋白最重要的泛素连接酶Mdm2相互作用。作为脚手架分子,gp96的M端结构域和N端结构域可分别与p53和Mdm2相互结合,促进Mdm2对p53蛋白的泛素化和蛋白酶体降解。更重要的是,体内试验发现,RNAi干扰gp96的表达能显著促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的生长。总而言之。首先,我们的研究揭示了在肝癌细胞中p53水平变化的一个潜在机制。其次,我们的实验结果证明热休克蛋白可以作为一个重要的脚手架蛋白参与促进泛素连接酶Mdm2对p53的泛素化连接以及随后的蛋白酶体降解,抑制细胞凋亡,促进肿瘤形成和恶化。更重要的是通过RNAi技术干扰gp96的表达能诱发更多的细胞凋亡以及在体内环境中抑制肿瘤的生长。鉴于gp96在肝肿瘤中是过量表达的,我们研究结果表明通过抑制gp96的功能可以作为一种新的肝癌治疗方法。