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白梭吻鲈(Sander lucioperca)属鲈科(percidae)、梭吻鲈属,是一种重要的亚冷水性经济鱼类,其最适生长水温在18-24℃,在夏季高温季节应激反应较强。为探究白梭吻鲈热应激机理,评价高温胁迫对白梭吻鲈机体的影响,本研究以23℃为对照组,设28℃、32℃、34℃和36℃四个试验温度梯度对梭鲈进行高温胁迫试验,测定了不同胁迫温度下白梭吻鲈肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)及丙二醛(MDA)活力,观察了不同温度下的鱼体肝脏组织损伤情况;检测了不同胁迫温度下血细胞、血清生化指标及离子浓度;进行了白梭吻鲈HSC70基因的克隆及表达分析。具体研究如下。1高温胁迫对梭鲈肝脏抗氧化酶的影响及组织损伤的分析本研究以23℃为对照组,设28℃、32℃、34℃和36℃四个试验温度梯度对梭鲈进行高温胁迫试验,探究了高温胁迫对白梭吻鲈(107±5g)肝脏组织抗氧化酶(SOD,CAT和GPX)和MDA活力的影响及肝脏组织损伤情况。结果显示温度升高对其肝脏抗氧化酶有显著影响。所有实验组中SOD、CAT和GPX的活力首先升高,之后降低。28℃组中SOD、CAT和GPX的含量与对照组相比均存在显著差异(P<0.05)。在34℃组中,SOD的活力达到最大值,并且是对照组的4.2倍。实验组中CAT的活力是对照组的1.7-3.5倍,且在28℃时达到最高,然后随处理温度升高而略微下降。GPX活力在28℃达到最大值,为对照组的5.8倍,之后随处理温度升高而下降,但除36℃组外,处理组梭鲈肝组织中GPX的活力与对照组均存在显著差异(P<0.05)。随着处理温度的升高,各处理组肝组织的MDA含量逐步升高,且所有实验组的MDA含量均与对照组存在显著差异(P<0.05)。不同温度下白梭吻鲈肝脏组织损伤结果显示,与对照组相比,肝脏细胞在28℃和32℃实验组中无显著变化。但是随着温度的升高,在32℃、34℃和36℃组中,肝细胞逐渐空泡化,相比34℃组,36℃组空泡在数量和大小上逐渐增加并且细胞核逐渐向细胞外围迁移。本研究发现23℃到32℃范围内,温度升高对白梭吻鲈肝脏抗氧化酶体系有一定影响,但是过高的温度(34℃和36℃)会导致肝脏抗氧化酶活力发生严重变化并且导致肝脏组织损伤。2高温胁迫对白梭吻鲈血液理化指标的影响本实验主要研究了高温胁迫对白梭吻鲈血液红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血红蛋白(Hb)、红细胞比容(PCV)、无机盐离子及血清相关生化指标的影响。结果表明,高温胁迫对白梭吻鲈血细胞及血清具有一定影响。与23℃对照组组相比,28℃和32℃实验组中RBC的数量和PCV没有显著变化(P>0.05),34℃和36℃组中RBC的数量和PCV显著增加(P<0.05)。28℃组中WBC的数量与23℃对照组相比没有显著变化(P>0.05),之后随着温度的提高,32℃、34℃和36℃组中WBC的数量与23℃对照组相比显著增加(P<0.05)。除了28℃和32℃组外,其他实验组中Hb的数量都与23℃组存在显著差异(P<0.05)。与23℃对照组相比,28℃和32℃组中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量显著提高(P<0.05),但是在34℃和36℃组中,这两种酶的含量与对照组相比没有显著差异(P>0.05)。实验组中白蛋白(ALB)、胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)的含量随着实验温度的提高呈下降趋势,并且与对照相比存在显著差异(P<0.05)。实验组中高密度脂蛋白(HDL)的含量随着实验温度的提高呈下降趋势,并且28℃和32℃组与23℃对照组存在显著差异(P<0.05)。随着实验组实验温度的提高,低密度脂蛋白(LDL)的含量逐步升高并且34℃和36℃组与对照组存在显著差异(P<0.05)。此外,高温胁迫下,白梭吻鲈血清中Ca2+、Mg2+和Na+的含量与23℃对照组相比没有显著差异(P>0.05)。3白梭吻鲈HSC70基因的克隆与表达分析本次实验得到白梭吻鲈组成型热休克蛋白70(HSC70)全长cDNA序列。cDNA序列全长2208bp,包含83 bp 5′-UTR,一个172 bp 3′-UTR和polyA尾,1953 bp开放阅读框(ORF),编码650个氨基酸。白梭吻鲈HSC70蛋白序列包含三个典型序列:DLGTTSV(aa 10–18),IFDLGGGTFDVSIL(aa 197–210),和IVLVGGST-RIPKIQK(aa 334–348)。白梭吻鲈HSC70蛋白序列包含HSP70家族共有序列:EEVD(aa 647–650)和三个碳端四肽序列GGMP(aa 615–618,aa 619–622,aa 627–630)。基于氨基酸序列的进化分析表明白梭吻鲈HSC70与翘嘴鳜相似度最高(98%),表明本研究得到的白梭吻鲈HSC70是HSP70家族成员。实时荧光定量PCR结果显示HSC70在对照组(23℃)白梭吻鲈的脑、心脏、脾脏、肌肉、肠道、胃和鳃等组织中均有表达。高温胁迫时,肝脏和脑中HSC70的表达量显著增加,表明肝脏和脑对高温胁迫的反应较其他组织更为敏感。白梭吻鲈鳃、肌肉和心脏中HSC70 mRNA的表达量在34℃组中达到最大值,在其他五种组织中,HSC70 mRNA表达量在36℃组中均达到最大值。本研究初步构建白梭吻鲈热胁迫模型,探究了高温胁迫对白梭吻鲈机体的肝脏抗氧化损伤、组织损伤、血液生理生化及热应激相关基因表达的影响,研究结果有助于对于白梭吻鲈抗热机理的解释提供一定的理论基础。