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目的:研究表明骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)可以减轻异基因造血干细胞移植(hematopietic stem cells transplantation,HSCT)后的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)。由于T淋巴细胞在GVHD的发生中起关键作用,故MSCs降低GVHD的原因可能为MSCs抑制T淋巴细胞反应,但具体机制还不清楚。本实验以植物血凝素(PHA)刺激人外周血淋巴细胞作为反应体系,观察人BM-MSCs与人外周血T淋巴细胞接触和非接触培养时活化的变化,并通过检测Th1/Th2细胞因子IL-10、IFN-γ及LFA-1mRNA水平表达,初步探讨其机制,为今后BM-MSCs的临床应用提供实验依据。方法:1人BMMSCs的培养、扩增和鉴定取营养性贫血患者骨髓液10 ml, Ficoll分离液分离后取中间细胞层,用含10%胎牛血清的F12-DMEM(1:1)培养液7ml,吹打混匀后接种于25cm2培养瓶中,置于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养, 48 h换液一次,后每2-3天换液1次。融合达80%-90%时,胰酶消化,继续传代培养。取传至第3代MSCs,消化离心收集细胞制成悬液。流式细胞仪检测细胞CD34、CD45、CD44表面抗原表达。2人外周血T淋巴细胞的分离、检测、鉴定取河北省血液中心提供的健康志愿献血者外周血白细胞滤器,用生理盐水反冲滤器获得血细胞悬液,Ficoll分离液分离提取单个核细胞,NH4CL溶液裂解红细胞,尼龙棉柱分离纯化T淋巴细胞,台盼蓝染色测细胞存活率,流式细胞术检测CD3表达阳性率。3 MSCs与T淋巴细胞分组混合培养3.1实验分组:A组: T淋巴细胞B组: T淋巴细胞+ PHA C组: MSCs + T淋巴细胞D组: MSCs + T淋巴细胞+ PHA E组: MSCs + T淋巴细胞(Transwell非接触培养) F组: MSCs + T淋巴细胞+ PHA (Transwell非接触培养)3.2混合培养采用12孔板,每组设3复孔,取P3代MSCs,以7.5×104 cells /孔的密度接种于C、D、E、F组,培养过夜使细胞贴壁,60Coγ射线5Gy照射去除细胞增殖分化能力。再将T淋巴细胞以2.5×106cells/孔的密度(MSCs:T细胞=1:30)接种于各孔,以含10%FBS的RPMI-1640培养液调整总体积至3.5ml。向B、D、F组中加入PHA,终浓度为25μg /ml,置于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养5天。4各组T淋巴细胞增殖活性测定混合培养5天后,吸出各孔T淋巴细胞(Transwell培养组先混匀再吸出)约1.43×105个转移至96孔细胞培养板中,MTT法测各孔吸光度OD值,每组实验重复三次。计算抑制率=[(对照组OD-实验组OD)/对照组OD]×100%。5各组T淋巴细胞细胞因子mRNA测定提取各组T淋巴细胞RNA,逆转录为cDNA,荧光定量PCR方法测定IL-10、IFN-γ、LFA-1等细胞因子mRNA表达量。引物序列(5’ - 3’): IL-10 forward: AGCTGTGGCCAGCTTGTTAT, reverse: TTCCATCTCCTGGGTTCAAG; IFN-γforward: GGTTCTCTTGGCTGTTACTGCC, reverse: GGACATTCAAGTCAGTTACCGAAT; LFA-1 forward: GGTTTGGACGCTCCATCCAT, reverse: ACTGGGGGTAGAGAGACTTGAT;β-actin forward:CTGGCACCACACCTTCTACAAT, reverse: AATGTCACGCACGATTTCCCGC。6统计分析采用SPSS13.0统计软件包处理,多个样本两两比较采用方差分析(Dunett’s T3),p<0.05为有统计学差异。结果:1 MSCs的培养8-10天后细胞形态均一,呈长梭形,排列呈漩涡状、网状、辐射状。传代细胞可保持原代细胞的形态特征,增殖也较原代细胞迅速,流式细胞仪检测结果显示,CD44表达强阳性,而CD34、CD45表达阴性,符合MSCs免疫表型。2用反冲外周血白细胞滤器的方法再经尼龙棉柱法分离纯化可获得足够数量的T淋巴细胞,台盼蓝拒染率大于95%,CD3+细胞大于80%,能够满足实验要求。3 MSCs细胞接种于12孔板贴壁后,60Co射线照射可去增殖。A组(T淋巴细胞)细胞均匀分布,增殖不明显;D组(MSCs+T淋巴细胞+PHA)与F组(MSCs+T淋巴细胞+ PHA Transwell非接触培养)淋巴细胞轻微聚集成团生长;而B组(T淋巴细胞+PHA)淋巴细胞明显聚集成团生长,增殖较A、D、F组均旺盛。4 T淋巴细胞增殖活性测定:A组、C组(MSCs+T淋巴细胞)、E组(MSCs+T淋巴细胞Transwell非接触培养)未加PHA,OD值与空白孔无差别(P>0.05);而B组OD值高于D、F组,且有统计学意义(P<0.05);而F组高于D组、A组,差别有统计学意义(P<0.05),D组与A组差别无显著性(P>0.05)其中D组T细胞抑制率为75.4%,F组为43.7%,提示MSCs可以抑制PHA刺激的T淋巴细胞增殖活性,且接触培养较非接触培养抑制作用明显。5混合培养各组IL-10、IFN-γ、LFA-1 mRNA的测定:IL-10 mRNA的表达量D、F两组比A、B两组高,差别有统计学意义(P<0.05),但A、B两组差别无意义(P>0.05),D、F两组差别也无意义(P>0.05);IFN-γmRNA的表达量B组高于A、D、F组,差别有统计学意义(P<0.05),而后三组表达量差别无统计学意义(P>0.05)。提示经PHA可以刺激T淋巴细胞合成IFN-γmRNA,但不影响IL-10 mRNA的合成量,MSCs可以降低IFN-γmRNA的表达量,升高IL-10 mRNA的表达量,且这种作用并不依赖细胞的直接接触。LFA-1是T淋巴细胞活化的标志,mRNA水平间接反应LFA-1表达情况,结果显示:B组表达LFA-1 mRNA的量高于A、D、F组,差别有统计学意义(P<0.05),而后三组表达量差别无显著性(P>0.05)。提示在PHA刺激下,T淋巴细胞合成LFA-1 mRNA增加,而MSCs也可以抑制这种反应,且并不依赖两种细胞的直接接触。结论:1 MSCs可以抑制PHA刺激的T淋巴细胞增殖,并且接触培养较非接触培养抑制作用明显。2 MSCs可以不依赖细胞之间的直接接触,降低PHA刺激的Thl细胞因子IFN-γmRNA表达量,升高Th2胞因子IL-10 mRNA的表达量。3 MSCs可以不依赖细胞之间的直接接触,降低PHA刺激的T细胞LFA-1 mRNA表达量,可能是抑制T细胞活化的原因之一。