表观遗传学研究在不改变DNA序列下的可遗传改变,DNA甲基化是表观遗传学研究的重要内容之一。以往的研究表明DNA甲基化在鱼类的性别决定和分化过程中具有重要作用,DNA甲基化酶在此过程中发挥的作用仍不清楚,本研究分析了DNA甲基化酶在脊椎动物中的系统进化及其成员扩增与动物全基因组复制的关系,并研究了DNA甲基化酶家族成员在尼罗罗非鱼不同组织、不同发育时期雌鱼(卵巢)和雄鱼(精巢)性腺以及由雌转雄次发性逆转过程中的表达。此外,在离体条件下,采用DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-dC)体外孵育罗非鱼性腺组织,研究了抑制剂处理对DNA甲基化酶以及雌、雄通路关键基因表达的影响;在在体条件下,采用不同浓度梯度5-aza-dC浸浴或腹腔注射仔稚鱼,研究了抑制剂处理对罗非鱼幼鱼骨骼发育和性腺分化的影响,初步评估了DNA甲基化酶在尼罗罗非鱼发育过程中的功能。主要研究结果如下:1)本研究在尼罗罗非鱼基因组中鉴定了7个DNA甲基化酶家族成员,包括dnmt1、dnmt2、dnmt3aa、dnmt3ab、dnmt3ba、dnmt3bb.1和dnmt3bb.2,此外还从海鞘、象鲨、腔棘鱼、爪蟾、原鸡、蜥蜴、小鼠、人、斑点雀鳝、三棘刺鱼、青鳉、河豚、斑马鱼和鲤鱼基因组中分别鉴定了3、4、4、4、4、5、5、5、5、7、5、7、8和12个DNA甲基化酶家族成员。本研究在1R动物分离鉴定1个dnmt3,2R动物分离鉴定了2-3个dnmt3,3R动物分离鉴定了4-6个dnmt3,4R动物分离鉴定了10个dnmt3,说明DNA甲基化酶家族成员数目增多主要是由于dnmt3亚家族成员复制增多引起的,同时表明DNA甲基化酶家族随着全基因组复制而发生了扩张,本结果支持了2R和3R假说。2)系统发育分析表明脊椎动物DNA甲基化酶家族分为dnmt1、dnmt2和dnmt3 3个亚家族,dnmt1和dnmt2在进化过程中比较保守,而dnmt3亚家族发生了分歧。共线性分析表明,在硬骨鱼中dnmt3a复制产生了dnmt3aa和dnmt3ab,dnmt3b复制产生了dnmt3ba和dnmt3bb.1,dnmt3bb.1经过串联复制产生了dnmt3bb.2,说明dnmt3亚家族在硬骨鱼和其他脊椎共同祖先发生了复制,在硬骨鱼辐射前和其他脊椎动物分离后发生了扩张。3)通过对8个不同组织(脑、心脏、肝脏、卵巢、精巢、肾脏、肌肉和头肾)转录组数据分析和RT-PCR验证,结果表明尼罗罗非鱼的7个DNA甲基化酶(dnmt1、dnmt2、dnmt3aa、dnmt3ab、dnmt3ba、dnmt3bb.1和dnmt3bb.2)在头肾和精巢都有表达,有6个在心脏、卵巢和肾脏有表达。此外,维持甲基化酶dnmt1在8个组织都有相对较高的表达,而从头甲基化酶dnmt3亚家族成员(dnmt3aa、dnmt3ab、dnmt3ba、dnmt3bb.1和dnmt3bb.2)在各个组织中的表达差异较大,其中dnmt3ba、dnmt3bb.1和dnmt3bb.2在性腺高表达。4)通过对四个不同发育时期(孵化后5、30、90和180天)及次发性逆转过程的雌雄性腺转录组数据分析和qPCR验证,结果表明所有的DNA甲基化酶都在性腺中表达,且在雌雄性腺中的表达具有显著差异,其中dnmt3aa、dnmt3ab、dnmt3bb.1和dnmt3bb.2在精巢中的表达高于卵巢,而dnmt1、dnmt2和dnmt3ba在卵巢中的表达高于精巢。此外,在由雌转雄的次发性逆转过程中dnmt3aa、dnmt3ab、dnmt3bb.1和dnmt3bb.2的表达显著升高,表明从头甲基化酶可能在尼罗罗非鱼性腺发育过程中具有重要作用。原位杂交检测结果表明了DNA甲基化酶家族成员主要表达于在卵巢组织中I和II时相卵母细胞和精巢组织中的精母细胞。5)通过DNA甲基化酶抑制剂5-aza-dC体外孵育罗非鱼雌雄性腺和性逆转性腺,发现5-aza-dC能够下调DNA甲基化酶家族成员的表达,同时上调雌性通路关键基因cyp19a1a和雄性通路关键基因dmrt1的表达。采用不同浓度梯度5-aza-dC浸浴罗非鱼鱼卵,发现与对照组相比,处理组幼鱼的死亡率和畸形率增加,茜素红染色结果表明处理组鱼脊柱弯曲变形。此外,采用较高浓度5-aza-dC腹腔注射孵化后5天的雌鱼,处理后60天和90天组织学检测发现有25-34%雌鱼性逆转为雄鱼,免疫组化结果表明,处理后60天,处理鱼性腺表达雄性特异基因dmrt1,不再表达雌性特异基因cyp19a1a。本研究结果表明DNA甲基化酶在尼罗罗非鱼发育过程中尤其是性腺发育过程中具有重要作用,其发挥作用的具体机制还有待进一步阐明。