茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)属于山茶科山茶属,是一种多年生常绿木本作物。茶树鲜叶是非酒精饮料‘茶’加工中重要的原材料,富含了多种于人体有益的次生代谢物质,如茶多酚(尤其是儿茶素)、茶氨酸和咖啡碱等。其中茶氨酸的含量与茶叶质量和保健功效息息相关。茶氨酸含量在茶树体内具有明显的品种和组织特异性,在采后茶叶加工过程中也具有一定的动态变化规律。茶氨酸代谢与氮代谢紧密联系,且在实际生长过程中经常受到缺氮胁迫,对氨基酸的积累和茶叶的感官品质造成负面影响。然而,关于上述实际现象和科学问题中茶氨酸代谢的分子机制尚未清楚,因此,本研究利用生物信息学、分子生物学和组学研究等技术手段,深入研究了在不同品种、组织中茶氨酸积累与代谢相关基因表达的相关性,在采后茶叶中茶氨酸代谢关键酶在蛋白和基因水平对茶氨酸动态变化的重要性,以及在氮缺乏和氮充足条件下,茶树新稍与根之间茶氨酸代谢差异和响应缺氮胁迫的分子机制。具体的研究内容及结论如下:1.通过高效液相色谱方法(HPLC),我们对‘黄金芽’、‘白叶一号’、‘迎霜’3种茶树的1芽1叶、2叶、3叶、老叶和侧根中的茶氨酸含量进行了测定。结果表明,随着茶树叶片成熟度增加茶氨酸含量逐渐降低,茎中含量最低,根中含量仅次于芽。在3个品种之间,‘黄金芽’叶和根的茶氨酸含量最高,其次是‘白叶一号’,‘迎霜’的含量最低。从GenBank和茶树转录组中鉴定了 17个编码茶氨酸代谢相关酶的基因,并对其在3种茶树的不同组织中的表达谱进行了比较分析。结果显示,在品种之间,大多数基因在‘黄金芽’中的表达量显著高于‘白叶一号’和‘迎霜’。茶氨酸含量在多数情况下与基因表达量呈正相关,且相关程度较大。在组织之间,‘黄金芽’组织间的CsGS1、CsALT、CsNADH-GOGAT、CsGDH2 和‘迎霜’组织间的 CsGGT1、CsGGT3 基因的表达量与茶氨酸含量呈正相关,而‘白叶一号’组织间的大多数基因的表达量与茶氨酸含量呈正相关,除CsTS1、CsFd-GOGAT、CsGGT3基因之外。2.对采后摊放的茶叶进行高温(38℃)、低温(4℃)、遮阴处理,借助蛋白组测序探索参与茶氨酸代谢相关的差异表达蛋白(DEPs)。利用超高效液相色谱(UPLC)方法,分析了采后摊放茶叶在不同处理下的茶氨酸含量变化规律。从相应的蛋白组数据中,鉴定了参与茶氨酸合成途径的DEPs谷氨酸合成酶CsFd-GOGAT和CsNADH-GOGAT。利用荧光定量 PCR(qRT-PCR),对包括CsFd-GOGAT和CsNADH-GOGAT在内的17个茶氨酸代谢相关基因的表达谱进行了分析。通过酵母双杂交技术验证了 CsFd-GOGAT和CsNADH-GOGAT、CsTS1和CsNiR之间的蛋白互作关系。通过分析茶氨酸含量变化与相关基因和蛋白表达之间的相关性,初步证明了谷氨酸合成酶在采后摊放茶叶茶氨酸代谢中的重要性。3.利用RNA-Seq技术对N6-R、N6+R、N6-S和N6+S 4个样品的转录响应情况进行了比较分析(6:处理6天;S:新稍(包含第1、第2、第3叶);R:根;+:氮充足;-:氮缺乏)。所获得的4个茶树转录组数据库,比对基因组的平均比对率为62.99%,共检测到基因数为38,998,其中已知的基因为28,812个,预测的新基因为10,186个。从中筛选得到162个茶氨酸代谢相关基因,涉及24种参与茶氨酸代谢的酶或转运蛋白。相关性分析表明,茶氨酸含量与这些基因水平均存在一定程度的相关性。同时茶氨酸含量与Glu、Ala、Arg、Val、Leu和Asp含量在氮充足下的新稍(N6+S)中具有较强的相关性,其中茶氨酸与Glu含量在不同组织中大多具有强相关性。从N6-R/N6+R、N6-S/N6+S、N6+R/N6+S、N6-R/N6-S 4个比对组中分别鉴定了 3 1、14、90、107个茶氨酸代谢相关的差异表达基因(DEGs),且上调基因均显著多于下调基因。通过qRT-PCR验证了部分茶氨酸代谢相关DEGs的上下调情况,分析显示与转录组预测结果相一致。4.采用iTRAQ技术对N6-R、N6+R、N6-S和N6+S 4个样品蛋白组进行定量分析,总共鉴定到4,912个蛋白。从N6-R/N6+R、N6-S/N6+S、N6+R/N6+S和N6-R/N6-S 4个比对组中分别筛选得到37、24、246和273个差异表达蛋白(DEPs)。将显著DEPs与DEGs进行关联分析,分别从上述4组中鉴定到8、1、138和157个DEPs-DEGs关系对。通过GO和KEGG分析,进一步将N6-R/N6-S和N6+R/N6+S中的关联蛋白进行功能分类。在各组的DEPs中和DEPs-DEGs关系对中,进而鉴定茶氨酸代谢相关蛋白。选取茶氨酸代谢中5种关键酶进行酶活性测定,并分析了酶活性与茶氨酸含量的相关性。5.选取N6-R、N6+R、N6-S和N6+S 4个样品构建小分子RNA文库,采用高通量测序技术挖掘茶氨酸代谢相关的microRNA信息。总共获得55,909,772个clean reads,将各样品中cleanreads比对到基因组的结果显示,在新稍中cleanreads的种类和总数量的比对率显著高于根,在对照组织中高于缺氮组织。通过比对分析和新miRNA预测,总共获得 6028 个 known miRNA 和 2829 个 novel miRNA。从N6-R/N6+R、N6-S/N6+S、N6-R/N6-S、N6+R/N6+S 4个比对组中分别筛选得到907、1432、2181、2416个差异表达miRNAs(DEMs)。通过DEMs和DEGs的关联分析发现,分别有547、319、5867、5807个DEMs-DEGs负关系对,其中分别有1、2、5、6对与茶氨酸代谢相关。选取DEMs-DEGs负关系对中的DEGs做进一步GO和KEGG Pathway功能富集分析。