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半纤维素是纤维素外植物细胞壁中含量最丰富的组份。半纤维素中50％的成份是木聚糖。木聚糖骨架的降解依赖两大类酶：内切木聚糖酶和β-木糖苷酶。内切木聚糖酶（EC3.2.1.8）可将木聚糖骨架降解成较小的低聚糖，这些低聚糖在β-木糖苷酶（EC3.2.1.37）的作用下降解成木糖。除了这两大类酶发挥主导作用外，其他一些酶类也参与了木聚糖的降解，如阿魏酸酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯糖酶、α-葡萄糖醛酸酶和对香豆酸酯酶，其中阿魏酸酯酶发挥关键作用。它能够水解植物细胞壁大分子之间通过阿魏酸或双阿魏酸形成的酯键，导致植物细胞壁复杂网络结构的破坏，使得其他水解酶更容易接近底物的作用中心。阿魏酸酯酶在饲料、食品、生物能源、化妆和医药工业等领域具有广泛的应用前景。 基于GenBank数据库黑曲霉（Aspergillus niger）阿魏酸酯酶A的序列设计引物，以A. niger h408染色体DNA为模板，通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）获得其阿魏酸酯酶A的全基因。DNA序列分析显示A. niger faeA（AnfaeA）全基因的长度为903bp，含有两个外显子，1个内含子。采用重叠延伸PCR技术成功克隆得到A. niger h408阿魏酸酯酶 A的cDNA基因（GenBank:KF911349）。测序结果显示黑曲霉faeA cDNA序列为783bp，含有1个开放阅读框架（ORF），编码260个氨基酸。Blast分析显示该基因和GenBank中黑曲霉阿魏酸酯酶序列同一性为99%，翻译的氨基酸序列含有脂酶典型的活性盖子和催化三联体结构。 将 AnfaeA基因和毕赤酵母表达载体 pPIC9K连接，成功构建重组质粒pPIC9K-Anfae，重组表达质粒经SacI线性化后电转化Pichia pastoris GS115，实现了黑曲霉阿魏酸酯酶A基因在P. pastoris GS115中的高效表达。平板透明圈法筛选到5株阿魏酸酯酶活性高的转化子，1株编号为pPIC9K-Anfae5的转化子阿魏酸酯酶活性最高，酶活达24.72U/mL，比活力为40.84U/mg，比黑曲霉出发菌株（22.1mU/mL）提高了1100倍左右。SDS-PAGE分析显示重组酶的分子量为33kDa，超出预期分子量28kDa。重组阿魏酸酯酶性质研究表明：其最适pH为5.0，且在pH4-9稳定性较好；最适反应温度50℃，在40-50℃时较稳定。 对重组毕赤酵母 pPIC9K-Anfae5进行了发酵条件优化，最佳的发酵条件为：接种量在5%-10%之间；初始生长pH及诱导pH为6.0左右；甲醇诱导浓度为1%，诱导时间为84h。在摇瓶诱导培养的基础上，对重组菌进行了50L和500L的发酵中试实验，结果表明：处于对数初期时即可检测到阿魏酸酯酶活，随发酵的进行酶活迅速升高，当菌体处于平稳期（84h）时酶活达到最高，分别为102.1U/mL、121.8U/mL，比摇瓶发酵的酶活提高了5倍左右。此后随时间延长，酶活趋于平稳，菌体密度开始下降，因此选用84h（甲醇诱导56h）作为发酵终止点。重组毕赤酵母的中试为该酶的工业化积累了数据和经验。 毕赤酵母发酵产阿魏酸酯酶的活性虽高，但是产酶品种单一，体外复合酶终究不如丝状真菌本身酶系齐全和比例适当，因此进行了阿魏酸酯酶在黑曲霉出发菌株中的表达。选用黑曲霉烯醇化酶基因的启动子（Peno）作为fae表达盒的启动子，深绿木霉丙酮酸脱酸化酶基因（Tpdc）的终止子作为fae表达盒的终止子，构建Peno-fae-Tpdc（PFT）表达盒，与潮霉素抗性质粒pAN7-1共转化黑曲霉原生质体，实现了AnfaeA在黑曲霉出发菌株中的组成性表达。经抗性复筛得到19株具有潮霉素抗性的转化子，在阿魏酸乙酯平板上有透明圈的有7株转化子。通过PCR验证7株转化子的基因组中均已经整合了构建的PFT表达盒。对7株重组子进行了发酵实验，其中一株编号为pft-4的转化子酶活最高，达567.46mU/mL，比相同培养条件下黑曲霉h408发酵提高了约251倍，尤其是产酶最高峰从第7d缩短至48h。7株转化子的发酵液酶活高低不一，可能是目的基因在黑曲霉染色体中整合的位置及拷贝数不同造成的，需通过进一步分子杂交验证。阿魏酸酯酶在黑曲霉中的成功表达为黑曲霉发酵生产高效纤维素酶和半纤维素酶提供了菌株和条件，并证明了黑曲霉烯醇化酶启动子是1个强启动子，为外源基因在黑曲霉表达提供了新的调控元件。