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研究背景与目的肾癌又称肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC),是最常见的成人肾脏实质恶性肿瘤,其发病率居泌尿系统肿瘤的第二位,占成人全身恶性肿瘤的3%,而且肾癌的发病率呈逐年上升的趋势。因肾癌早期症状不典型,起病隐袭,发现时多为晚期甚至已有远处转移,死亡率高。目前,外科手术治疗仍是肾癌的主要治疗方法,肾癌对放、化疗以及激素治疗等均不敏感,故而预后较差。故而对肾癌的早期诊断以及有效的术后辅助治疗尤其重要。近年来研究发现,G250显示出良好的肿瘤特异性。98%的肾癌原发灶高表达G250抗原,特别是肾透明细胞癌几乎全部表达G250抗原,而该抗原在正常肾脏组织中不表达。它对肾脏肿瘤细胞的存活,生长及转移都发挥了重要的作用。被认为是较为理想的肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA),在肾癌的早期诊断及预后判断和术后的辅助生物治疗等方面有较好的应用前景。研究证实肾癌G250抗原中由氨基酸249-268(G250肽/249)形成的抗原肽,包含Th表位和CTL表位,可同时诱导CD4+及CD8+的T细胞免疫反应,可刺激机体产生针对该肽的抗肾癌免疫反应,故G250肽／249可作为肾癌免疫治疗的理想靶点。基于以上理论基础,本实验前期利用基因工程技术将编码鼠G250肽/249的基因片段插入到HBcAg的主要免疫优势区(MIR),构建出原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,并通过原核表达和纯化获得重组融合蛋白,本实验将前期重组构建完成的原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C重组至(?)PVAX1质粒上,成功构建了质粒DNA疫苗PVAX1/C-G250肽-C。但DNA质粒疫苗存在免疫原性弱的缺点,为最大程度的加强免疫反应水平,本课题应用PEI做免疫佐剂增强DNA疫苗的免疫反应水平。并应用G250肽疫苗作为冲击构建异源性prime-boost免疫策略,探讨PEI作为免疫佐剂对G250抗原肽基因PVAX1/C-G250肽-C免疫效果的增强及联合应用G250蛋白疫苗进行PRIME—BOOST免疫程序免疫增强效果的研究。为肾癌免疫治疗疫苗的研究方面做出补充和探索性创新。目的研究方法1.重组质粒PVAX1/C-G250肽-C的制备：用EcoR I.Xho I和EcoR I.Sal I分别双酶切PVAXl及前期构建的pET28a (+)/C-G250肽-C质粒。因Xho1和Sal1共尾,故可利用DNA重组技术构建重组质粒PVAX1/C-G250肽-C。酶切分析鉴定正确。大量提取质粒后,分光光度计测质粒含量。2.PEI佐剂提高效应及prime-boost免疫策略免疫水平提升的研究：将24只雌性昆明小鼠随机分为(A)裸DNA组,(B)DNA-PEI复合物组,(C)DNA-PEI+蛋白疫苗组(D)空白对照组。按0,10,20,30天程序经股四头肌注射免疫。(C)组在第20天及第30天进行蛋白冲击。初次免疫前和第40天鼠尾取血,ELISA法检测抗体滴度。流式细胞术测淋巴细胞亚群,CD4+和CD8+。研究结果1.双酶切及基因测序鉴定证实G250抗原肽cDNA正确插入PVAX1/C-G250肽-C重组质粒中。2.昆明小鼠经4次免疫后,3个实验组都产生了特异性的体液和细胞免疫反应,但DNA-PEI复合物组的抗体滴度1：1.28×104及CD4+,CD8+分别占到26.12%和12.60%明显高于裸DNA组的1：3.2×103和CD4+,CD8+占到19.32%和10.74%。而蛋白冲击组的1：5.12×104和CD4+,CD8+占到41.96%和15.14%又明显高于复合物组,且差异有统计学意义。结论1.成功构建重组质粒DNA疫苗PVAX1/C-G250肽-C。2.该DNA疫苗与PEI和G250蛋白疫苗联合使用后产生极强的免疫原性,诱导产生了高滴度,高特异性抗体及细胞免疫反应。证实G250DNA疫苗联合PEI使用并进行蛋白疫苗冲击的免疫策略可产生强大的免疫保护作用。为肾癌的术后辅助治疗提供新的思路和方法。