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研究背景隐匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection,OBI)是指患者血清HBsAg阴性,肝组织HBV DNA阳性(伴或不伴有血清HBV DNA阳性)。若患者血清中HBV DNA阳性,HBV低水平复制,HBV DNA<200IU/ml。OBI不仅可以通过输血、器官移植和透析等方式传播HBV,而且与肝硬化和肝细胞癌的发生密切相关。乙型肝炎病毒核心蛋白具有多种功能,在pgRNA和pol多聚酶的衣壳化、核衣壳的解离和聚合、病毒颗粒的成熟中具有重要的作用。OBI的发生与HBV的基因突变密切相关,现有的研究主要针对HBV的S区和BCP区的变异,乙型肝炎病毒核心蛋白区(C区)变异在OBI的发生发展中的作用机制目前仍不清楚。研究目的探索乙型肝炎病毒核心蛋白区(C区)变异在隐匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)中的作用。研究方法本研究通过重叠延伸PCR和定点突变PCR技术构建含有不同突变位的乙型肝炎病毒核心蛋白区突变型质粒,通过细胞免疫荧光检测肝组织HBcAg的分布情况,western blot检测HBcAg表达水平,化学发光法检测HBsAg和HBeAg的表达水平,免疫组织化学检测小鼠肝组织HBcAg的表达情况,RT-PCR检测小鼠肝组织中HBV RNA的水平。实验结果利用重叠PCR和定点突变技术成功构建单点、双联和三联突变的OBI毒株和野生株。HBcAg在HuH7细胞有三种不同分布类型。A类包括wt、SZB、SZA-R62W、wt-P50H、wt-L55I、wt-W62R、wt-S74G、wt-S87G、wt-L95I、wt-I97L、wt-T142M、wt-T147A、SZA-H50P/R62W、SZA-P50H/R62W/G74S、SZA-R62W/G74S、wt-P50H/L95I;B 类包括 SZA、SZA-H50P、SZA-I55L、SZA-G74S、SZA-G87S、SZA-I95L、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A147T;C 类包括 wt-P50H/W62R、wt-P50H/W62R/S74G、wt-P50H/W62R/S87G、wt-P50H/W62R/T147A、wt-W62R/L95I。OBI 毒株 SZA、SZA-G87S、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A147T、wt-P50H/W62R/S74G 的 HBcAg 表达水平低于野毒株,SZA-H50P、SZA-I55L、SZA-R62W、SZA-G74S、SZA-I95L 的 HBcAg 表达水平高于 SZA 的 HBcAg 表达水平。OBI毒株SZA和SZB胞内和胞外HBeAg水平低于野毒株。OBI毒株SZA的 5 个单点回复突变 SZA-H50P、SZA-I55L、SZA-R62W、SZA-G74S、SZA-I95L可轻度提高胞内和胞外HBeAg水平,SZA的4个单点回复突变SZA-G87S、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A147T对其无明显影响。SZA的双联和三联回复突变的HBeAg表达水平要高于单点回复突变。野毒株的单点突变wt-P50H和wt-W62R 可降低 HBeAg 水平,而双联突变 wt-P50H/W62R、wt-W62R/L95I,三联突变 wt-P50H/W62R/S87G、wt-P50H/W62R/T147A 的 HBeAg 表达水平低于野生型的单点突变。OBI毒株SZA在Balb/c小鼠肝组织不表达HBcAg,SZB在肝组织表达HBcAg。野毒株在肝组织表达HBcAg,分布类型为Ⅲ型。OBI毒株SZA的8个单点回复突变 SZA-H50P、SZA-I55L、SZA-G74S、SZA-G87S、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A147T不表达HBcAg。单点回复突变SZA-R62W,双联回复突变 SZA-H50P/R62W、SZA-R62W/G74S,三联回复突变 SZA-P50H/R62W/G74S可提高HBcAg的表达水平。野毒株的单点、双联、三联突变不影响HBcAg的表达水平。Balb/c小鼠血清中,OBI毒株SZA的8个单点回复突变SZA-H50P、SZA-I55L、SZA-G74S、SZA-G87S、SZA-I95L、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A147T的HBeAg表达水平差异不明显,SZA的单点回复突变SZA-R62W能显著提高HBeAg的表达水平。野毒株的单点突变wt-P50H、wt-W62R,双联突变 wt-P50H/W62R、wt-W62R/L95I,三联突变 wt-P50H/W62R/S87G、wt-P50H/W62R/T147A的HBeAg表达水平低于野毒株其它位点的单点突变。第1周和第7周,SZA在小鼠肝组织始终不表达HBcAg。第1周,wt在小鼠肝脏中表达HBcAg,并且在第7周HBcAg的表达水平明显上升。第1周,小鼠肝脏中SZA的HBV total RNA和C region RNA水平均低于野毒株。第七周,小鼠肝脏中SZA的HBV total RNA和C region RNA均高于野毒株。OBI毒株SZA的HBeAg长期处于低表达水平(10-15 S/CO)。野毒株HBeAg长期处于高表达水平(500-1500 S/CO)。OBI毒株的C区的P50H、W62R、S74G、S87G、L95I的联合变异改变HBcAg、HBeAg、HBV RNA的表达水平,其中W62R起着最关键的作用。乙性肝炎病毒C区变异对OBI的形成具有重要作用。结论OBI毒株的C区的P50H、W62R、S74G、S87G、L95I的联合变异改变HBcAg、HBeAg、HBV RNA的表达水平,其中W62R起着最关键的作用。乙性肝炎病毒C区变异对OBI的形成具有重要作用。