【摘 要】
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目的:通过TGF-β1刺激建立小鼠纤维化模型以此模拟人体内肺纤维化反应,探讨在10ng/m L TGF-β1诱导小鼠肺成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转换的过程中,不同浓度的ERK1/2信号通路阻断剂U0126对肺纤维化以及TGF-β1/Smad3通路的影响,同时了解肺纤维化过程中多条通路可能的相互作用,以期在细胞分子水平丰富特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis,
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目的:通过TGF-β1刺激建立小鼠纤维化模型以此模拟人体内肺纤维化反应,探讨在10ng/m L TGF-β1诱导小鼠肺成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转换的过程中,不同浓度的ERK1/2信号通路阻断剂U0126对肺纤维化以及TGF-β1/Smad3通路的影响,同时了解肺纤维化过程中多条通路可能的相互作用,以期在细胞分子水平丰富特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）发病机制的研究,并为抗纤维化治疗提供更多理论依据。方法:以体外培养的小鼠肺成纤维细胞（即L929细胞系）为实验对象,从细胞水平层面用外源活性TGF-β1刺激建立小鼠肺纤维化模型,随机将实验分为以下5组:空白对照组、10ng/m L TGF-β1组（即模型组）、10ng/m L TGF-β1+2.5u M U0126抑制剂组（即低剂量抑制剂组）、10ng/m L TGF-β1+5u M U0126抑制剂组（即中剂量抑制剂组）、10ng/m L TGF-β1+10u M U0126抑制剂组（即高剂量抑制剂组）。将以上各实验组细胞培养24小时,收集细胞,采用实时荧光定量反转录PCR技术（RT-q PCR）检测L929细胞内纤维化表型标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原及ERK1/2上游分子EGFR的转录水平。采用免疫蛋白印记技术（Western Blot）检测ERK1/2、Smad3蛋白磷酸化水平。收集检测数据并进行统计分析。结果:（1）与空白对照组的I型胶原、α-SMA m RNA（相对表达量分别为:1.049±0.0159、1.143±0.1293）相比,单纯由外源性10ng/m L TGF-β1刺激下建立的模型组I型胶原、α-SMA在转录水平均表达上调,其相对表达量分别为:1.859±0.0243、2.074±0.0105,组间表达差异明显（P<0.05）;（2）与模型组相比,低剂量抑制剂组、中剂量抑制剂组及高剂量抑制剂组的I型胶原、α-SMA在转录水平均表达下调,其中低剂量抑制剂组的I型胶原、α-SMA相对表达量分别为:1.609±0.0079、1.840±0.0877,中剂量抑制剂组的I型胶原、α-SMA相对表达量分别为:1.284±0.0016、1.512±0.1120,高剂量抑制剂组的I型胶原、α-SMA相对表达量分别为:1.497±0.0032、1.651±0.0979,各两组间表达差异显著（P<0.05）;另外,中剂量抑制剂组I型胶原、α-SMA m RNA表达均低于低剂量抑制剂组,组间差异明显（P<0.05）,而高剂量与中剂量抑制剂组相比,I型胶原、α-SMA m RNA组间表达无显著差异（P>0.05）;与对照组相比,模型组EGFR m RNA表达无明显差异（P>0.05）。（3）与空白对照组比较,模型组的ERK1/2、Smad3蛋白磷酸化表达均表现为上调,组间表达有显著差异（P<0.05）;与模型组相比,低剂量抑制剂组、中剂量抑制剂组、高剂量抑制剂组的ERK1/2、Smad3蛋白磷酸化均表达为下调,各两组间差异表达显著（P<0.05）。结论:（1）TGF-β1在小鼠肺成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转换的过程中起正向调控的作用,调控机制与其介导的ERK1/2信号通路及Smad3通路相关。（2）TGF-β1在肺纤维化中介导ERK1/2通路时可能不经过其上游信号分子EGFR而是直接对ERK1/2层面产生影响。（3）U0126阻断剂可同时抑制肺纤维化过程中TGF-β1介导的ERK1/2信号通路及Smad3通路,且对纤维化反应的抑制程度可能与U0126剂量相关,鉴于U0126对多通路的阻断作用,为治疗肺纤维化提供了更多依据。（4）IPF的发生机制可能与多条信号通路相互间的网络化反应有关,即所谓的信号通路间的“串话”现象。
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