【背景和目的】:原发性支气管肺癌是当今世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,严重威胁人类的健康和生命。随着环境污染尤其是空气污染的加剧,我国肺癌发病率持续快速上升,且有低龄化趋势。尽管近年来手术、化疗、靶向治疗等综合治疗效果明显改善,但其5年生存率仍较低。因此除了传统的治疗手段外,肿瘤的免疫治疗以及肿瘤微环境的影响受到越来越多学者的关注。肿瘤相关性炎症已经成为肿瘤的“无限复制的潜能、促血管生成、对程序性细胞死亡的逃逸、生长信号的自给自足、对生长抑制剂的不敏感、组织侵犯和转移”之外的“第七大特征”[1]。炎症(inflammation)是机体抵御外界病原体侵袭以及各种化学、物理性损伤的免疫反应。慢性炎症可以促进肿瘤的发生和发展,并参与肿瘤细胞的发生、生长和转移的各病理过程。炎症小体(inflammasome)是由胞浆内模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)参与组装的多蛋白复合物,能启动和参与炎症反应的核心环节。NLRP3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3)炎症小体是目前研究较多且能被多种刺激物活化的炎症小体。文献显示NLRP3炎症小体参与多种肿瘤(如黑色素瘤、肝癌、胃癌等)的进展过程,但在不同的肿瘤中发挥的作用不同甚至相反,具有一定的细胞或组织特异性。因此,本实验将研究NLRP3炎症小体活化对肺腺癌细胞株A549生物学特征的影响及其可能的作用机制,为临床治疗肺腺癌提供新的思路及理论基础。【方法】:1.我们用细胞免疫荧光、western blot、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测在A549细胞中NLRP3炎症小体是否能够活化。2.用Ed U增殖摻入方法检测NLRP3炎症小体活化后对A549细胞增殖的影响。用Annexin V/PI染色流式细胞仪检测NLRP3炎症小体活化后对A549细胞凋亡的影响。此外,用慢病毒干扰(sh NLRP3)方法稳定下调NLRP3表达,caspase-1抑制剂z-YVAD-FMK抑制caspase-1,IL-18结合蛋白(interleukin-18binding protein,IL-18BP)、IL-1受体拮抗剂(IL-1receptor antagonist,IL-1Ra)阻断IL-18、IL-1β信号通路,从这三个方面抑制NLRP3炎症小体的活性后,用Ed U增殖摻入方法观察细胞增殖情况的变化。用western blot方法检测p-Akt、p-GSK-3β、p-ERK1/2、p-CREB等信号通路的变化。3.用细胞划痕实验、transwell小室迁移实验检测NLRP3炎症小体活化后对A549细胞迁移的影响。用Matrigel侵袭实验检测NLRP3炎症小体活化后对A549细胞侵袭的影响。此外,从这三个方面抑制NLRP3炎症小体的活性:即用慢病毒干扰(sh NLRP3)方法稳定下调NLRP3表达,caspase-1抑制剂z-YVAD-FMK抑制caspase-1,IL-18结合蛋白(IL-18BP)、IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)阻断IL-18、IL-1β信号通路后,观察细胞迁移、侵袭情况的变化。用western blot方法检测Snail、E-cadherin等信号通路的变化。【结果】:1.使用经典的NLRP3炎症小体刺激剂LPS+ATP后,细胞免疫荧光显示在LPS+ATP组有较多的点状沉积代表NLRP3和接头蛋白ASC的结合,western blot显示活性形式的capspe-1 p10明显增高,ELISA显示细胞外IL-18、IL-1β明显增高,而在control组、LPS组、ATP组没有出现这些结果,说明LPS联合ATP可以在A549细胞中激活NLRP3炎症小体。2.LPS+ATP活化NLRP3炎症小体后促进了A549细胞增殖,p-Akt、p-GSK-3β、p-ERK1/2、p-CREB明显增高。在sh Ctrl细胞中,LPS+ATP同样促进细胞增殖及上调p-Akt、p-GSK-3β、p-ERK1/2、p-CREB,但在sh NLRP3细胞中,LPS+ATP的上述作用没有显现,说明通过sh NLRP3稳定下调NLRP3而抑制炎症小体活性后可以逆转LPS+ATP的作用。Caspase-1抑制剂z-YVAD-FMK部分抑制LPS+ATP的促增殖作用,使上调的p-Akt、p-GSK-3β、p-ERK1/2、p-CREB下降但仍高于control水平。单独使用IL-18BP或IL-1Ra均可部分抑制LPS+ATP的促增殖作用,IL-18BP对Akt/GSK-3β信号通路的影响相对更大,IL-1Ra对ERK1/2信号通路的影响相对更大,联合使用IL-18BP和IL-1Ra可以阻断LPS+ATP的促增殖作用。3.Annexin V/PI染色流式细胞仪检测结果显示NLRP3炎症小体活化对A549细胞的凋亡无明显影响。4.NLRP3炎症小体活化促进了A549细胞迁移、侵袭。5.NLRP3炎症小体对A549细胞迁移和侵袭的影响,可能的信号通路包括E-cadherin、Snail。LPS+ATP组,细胞E-cadherin表达下降,Snail表达升高。在sh Ctrl细胞中,LPS+ATP同样促进细胞迁移、侵袭及下调E-cadherin、上调Snail,但在sh NLRP3细胞中,LPS+ATP的上述作用没有显现,说明通过sh NLRP3稳定下调NLRP3而抑制炎症小体活性后可以逆转LPS+ATP的作用。Caspase-1抑制剂z-YVAD-FMK部分抑制LPS+ATP的促迁移、促侵袭作用,但使下降的E-cadherin上调至control水平、升高的Snail下调至control水平,而只是部分抑制了p-JNK、p-p38、p-ERK1/2的丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases,MAPK)信号通路。单独使用IL-18BP或IL-1Ra均可部分抑制LPS+ATP的促迁移、促侵袭作用,使下降的E-cadherin上调、升高的Snail下调,但仍与control组有明显差异,而联合使用IL-18BP和IL-1Ra可以阻断LPS+ATP的促迁移、促侵袭作用,使E-cadherin、Snail变化至基础水平。【结论】:1.NLRP3炎症小体活化可以促进A549细胞增殖、迁移、侵袭,可能通过调节p-Akt、p-GSK-3β、p-ERK1/2、p-CREB、E-cadherin、Snail、MAPK等信号通路而发挥作用。2.NLRP3炎症小体可以作为调节肺腺癌增殖、迁移、侵袭的细胞内信号,可能成为肺癌潜在的治疗靶点。