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谷子起源于中国,广泛种植于我国北方地区。具有抗旱、耐逆性强、营养价值高等优点,被认为是应对未来日益干旱环境的战略储备作物。由谷瘟病菌引起的谷瘟病是谷子生产中的重要病害,近年来有愈发严重的趋势。本研究通过对谷瘟病菌生理小种鉴定、rDNA-IGS序列分析、Pot2-rep-PCR分子指纹图谱分析和无毒基因鉴定等多种方法研究我国不同谷子产区谷瘟病菌群体遗传结构的多样性。并利用PCR扩增技术,明确我国谷子产区谷瘟病菌交配型的分布情况。主要结果如下:
1.利用6个鉴别寄主,将2012年的204株谷瘟病菌单孢菌株划分成7群28个生理小种。C群在7个种群中出现的频率最高,为本研究的优势菌群;C17在28个生理小种中出现的频率最高,为优势小种。对谷瘟病菌生理小种的地区分布进行分析,发现不同谷子产区的谷瘟病菌生理小种存在地区特异性,但并不遵循严格的地理隔离。
2.对谷瘟病菌rDNA-IGS序列进行分析,发现谷瘟病菌rDNA-IGS序列的扩增长度呈明显的多态性,谷瘟病菌与稻瘟病菌的rDNA-IGS序列存在显著的差异。序列中重复单元(GGGGGTCAGGGTA和CATTTTT)重复次数的不同是造成谷瘟病菌rDNA-IGS序列长度差异的主要原因。对谷瘟病菌rDNA-IGS序列进行系统发育分析,发现谷瘟病菌遗传分化明显,具有丰富的遗传多样性,谷瘟病菌群体遗传分化与地理来源无明显相关性,而与寄主类型存在相关性。
3.利用Pot2-rep-PCR分子标记,对2015年和2016年共249株谷瘟病菌进行检测。结果发现,不同菌株扩增出的条带个数在1~13条之间,片段大小在0.38kb~22.3kb之间,说明谷瘟病菌菌株在DNA水平上具有丰富的多态性。基于UPGRMA聚类分析发现,在0.85相似水平下,2015年的133株谷瘟病菌菌株共划分为20个遗传宗谱,包含一个优势宗谱GL1和多个特异性宗谱;2016年的116个供试菌株划分为23个遗传宗谱,同样包含一个优势宗谱ZB2和多个特异性宗谱。对两年间谷瘟病菌群体的时空分布进行分析,结果发现,不同地区、不同年份的谷瘟病菌群体遗传结构具有差异性。谷瘟病菌群体呈扩张趋势,群体间未形成明显的地理隔离。
4.对谷瘟病菌无毒基因进行PCR检测,结果发现,无毒基因ACE1、AVR-Pita、AVR1-CO39、AvrPiz-t、Avr-Pi54、PWL3和PWL4的扩增率为100%,Avr-Pib、AvrPi9、Avr-pik、Avr-pia、Avr-pii和PWL2的扩增率分别为98.79%、97.99%、56.63%、33.34%、20.48%和26.10%,未能扩增出无毒基因PWL1。分析表明,谷瘟病菌群体无毒基因的分布具有时空差异性,未形成明显的地理隔离。无毒基因ACE1、Avr-Pib和AvrPi9编码区序列较为保守未发现序列变异;无毒基因PWL2、Avr-pia和Avr-pii变异方式主要为无毒基因序列的缺失,同时也包含编码区序列核苷酸的变异;AVR-Pita、AVR1-CO39、AvrPiz-t、Avr-Pi54和Avr-pik的编码区序列变异丰富,变异方式包括无毒基因的缺失、转座子的插入,单核苷酸的插入、缺失和突变等。利用谷瘟病菌与稻瘟病菌无毒基因PWL3序列的差异,可从分子水平上快速区分两者。
5.对我国11个省份171株谷瘟病菌的无毒基因AVR1-CO39进行扩增测序,并利用ClustalX2.0和DnaSP5.0软件对测序结果进行分析。结果发现,171株谷瘟病菌单孢菌株AVR1-CO39的CDS编码区共包含40个多态性位点,依据序列之间的核苷酸差异划分为37个单倍型,H1型为绝对优势单倍型。我国11个省份谷瘟病菌群体的AVR1-CO39具有较高的遗传多态性,由于存在较为频繁的基因交流,种群之间没有明显的遗传分化。种群内部的遗传分化是谷瘟病菌遗传分化的主要方式,错配分布检测结果显示进化过程中可能出现群体扩张,并且谷瘟病菌的聚类与地理来源没有显著的关系。
6.采用PCR扩增的方法,对249株谷瘟病菌的交配型进行分子鉴定。结果发现,夏谷区谷瘟病菌64.17%的菌株为MAT1-1交配型,而交配型为MAT1-2的菌株仅占26.67%,其余9.17%菌株为双交配型菌株。春谷区谷瘟病菌的交配型为MAT1-1占40.83%,而交配型为MAT1-2的菌株占55.83%,其余3.33%菌株为双交配型菌株。通过该方法检测多数谷子种植区存在MAT1-1与MAT1-2两种交配型的谷瘟病菌菌株,且总体上两种交配型菌株比例接近1∶1。但不同地区两种交配型菌株所占比例有一定差异,并且自然界中存在谷瘟病菌两性菌株。
1.利用6个鉴别寄主,将2012年的204株谷瘟病菌单孢菌株划分成7群28个生理小种。C群在7个种群中出现的频率最高,为本研究的优势菌群;C17在28个生理小种中出现的频率最高,为优势小种。对谷瘟病菌生理小种的地区分布进行分析,发现不同谷子产区的谷瘟病菌生理小种存在地区特异性,但并不遵循严格的地理隔离。
2.对谷瘟病菌rDNA-IGS序列进行分析,发现谷瘟病菌rDNA-IGS序列的扩增长度呈明显的多态性,谷瘟病菌与稻瘟病菌的rDNA-IGS序列存在显著的差异。序列中重复单元(GGGGGTCAGGGTA和CATTTTT)重复次数的不同是造成谷瘟病菌rDNA-IGS序列长度差异的主要原因。对谷瘟病菌rDNA-IGS序列进行系统发育分析,发现谷瘟病菌遗传分化明显,具有丰富的遗传多样性,谷瘟病菌群体遗传分化与地理来源无明显相关性,而与寄主类型存在相关性。
3.利用Pot2-rep-PCR分子标记,对2015年和2016年共249株谷瘟病菌进行检测。结果发现,不同菌株扩增出的条带个数在1~13条之间,片段大小在0.38kb~22.3kb之间,说明谷瘟病菌菌株在DNA水平上具有丰富的多态性。基于UPGRMA聚类分析发现,在0.85相似水平下,2015年的133株谷瘟病菌菌株共划分为20个遗传宗谱,包含一个优势宗谱GL1和多个特异性宗谱;2016年的116个供试菌株划分为23个遗传宗谱,同样包含一个优势宗谱ZB2和多个特异性宗谱。对两年间谷瘟病菌群体的时空分布进行分析,结果发现,不同地区、不同年份的谷瘟病菌群体遗传结构具有差异性。谷瘟病菌群体呈扩张趋势,群体间未形成明显的地理隔离。
4.对谷瘟病菌无毒基因进行PCR检测,结果发现,无毒基因ACE1、AVR-Pita、AVR1-CO39、AvrPiz-t、Avr-Pi54、PWL3和PWL4的扩增率为100%,Avr-Pib、AvrPi9、Avr-pik、Avr-pia、Avr-pii和PWL2的扩增率分别为98.79%、97.99%、56.63%、33.34%、20.48%和26.10%,未能扩增出无毒基因PWL1。分析表明,谷瘟病菌群体无毒基因的分布具有时空差异性,未形成明显的地理隔离。无毒基因ACE1、Avr-Pib和AvrPi9编码区序列较为保守未发现序列变异;无毒基因PWL2、Avr-pia和Avr-pii变异方式主要为无毒基因序列的缺失,同时也包含编码区序列核苷酸的变异;AVR-Pita、AVR1-CO39、AvrPiz-t、Avr-Pi54和Avr-pik的编码区序列变异丰富,变异方式包括无毒基因的缺失、转座子的插入,单核苷酸的插入、缺失和突变等。利用谷瘟病菌与稻瘟病菌无毒基因PWL3序列的差异,可从分子水平上快速区分两者。
5.对我国11个省份171株谷瘟病菌的无毒基因AVR1-CO39进行扩增测序,并利用ClustalX2.0和DnaSP5.0软件对测序结果进行分析。结果发现,171株谷瘟病菌单孢菌株AVR1-CO39的CDS编码区共包含40个多态性位点,依据序列之间的核苷酸差异划分为37个单倍型,H1型为绝对优势单倍型。我国11个省份谷瘟病菌群体的AVR1-CO39具有较高的遗传多态性,由于存在较为频繁的基因交流,种群之间没有明显的遗传分化。种群内部的遗传分化是谷瘟病菌遗传分化的主要方式,错配分布检测结果显示进化过程中可能出现群体扩张,并且谷瘟病菌的聚类与地理来源没有显著的关系。
6.采用PCR扩增的方法,对249株谷瘟病菌的交配型进行分子鉴定。结果发现,夏谷区谷瘟病菌64.17%的菌株为MAT1-1交配型,而交配型为MAT1-2的菌株仅占26.67%,其余9.17%菌株为双交配型菌株。春谷区谷瘟病菌的交配型为MAT1-1占40.83%,而交配型为MAT1-2的菌株占55.83%,其余3.33%菌株为双交配型菌株。通过该方法检测多数谷子种植区存在MAT1-1与MAT1-2两种交配型的谷瘟病菌菌株,且总体上两种交配型菌株比例接近1∶1。但不同地区两种交配型菌株所占比例有一定差异,并且自然界中存在谷瘟病菌两性菌株。