莱茵衣藻是研究脂质生物合成与工程化高脂质积累菌株的模式生物。研究表明,分别调控长链酰基辅酶A合成酶（LACS2）、柠檬酸合酶（CIS1）和转录因子（DOF）均能提高脂肪酸含量。LACS2活化脂肪酸进入β-氧化,CIS1催化TCA循环第一步反应,DOF转录因子调控碳氮代谢途径。本研究综合三条不同的途径增加油脂的积累,将双沉默基因LACS2-CIS1转入DOF工程藻中得到三基因工程藻,并分析了该工程藻的生长状况、淀粉、蛋白质、脂肪酸以及在转录水平分析了多条通路关键基因的变化。具体研究结果如下:1.首先构建了双基因 LACS2-CIS1 的RNAi 的干涉载体pMaa 7IR/LACS2-CIS1IR。该载体在莱茵衣藻表现潮霉素抗性,可高效抑制莱茵衣藻内源LACS2和CIS1的基因表达量。2.将pMaa 7IR/LACS2-CIS1IR转入DOF工程藻中获得150株转化子,经尼罗红染色筛选得到33株油脂含量较高的工程藻。对工程藻DLC-4的DOF、LACS2和CIS 1基因表达量分析显示,热诱导后与DOF工程藻相比,LACS2和CIS 1基因分别下调了 58%和26%。与WT相比,DOF、LACS2和CIS1基因分别上调了121%,下调了 53.3%和46.9%。这些数据表明工程藻DLC-4实现三基因共调控。3.DLC-4胞内脂肪酸含量在热诱导前后分别提高了 31%和52%。其中脂酸酸组分提高较高的是C16:0、C18:0、C18:1和C18:3。热诱导后,与DOF工程藻相比,工程藻DLC-4胞内脂肪酸含量提高了 25%。尼罗红进一步分析,氮耗竭下DLC-4的TAG含量提高了 142%。淀粉和蛋白含量显示,热诱导前与WT相比,DLC-4淀粉和蛋白含量略微下降;热诱导后,与WT相比,DLC-4的淀粉含量下降了 45%和蛋白含量下降24%。这些结果表明,热诱导后,存在淀粉和蛋白的下降为脂肪酸合成提供能量和前体物质。4.为进一步理解工程藻DLC-4油脂积累的机制,转录组分析热诱导后DLC-4和WT的基因表达。结果表明,参与支链氨基酸的分解代谢的7个蛋白中有5个蛋白活性上调以及参与淀粉合成的4个淀粉合酶的下调和α-淀粉酶的上调,这些表明蛋白和淀粉在降解。随后,乙酰辅酶A含量的增加和脂肪酸合酶活性的上调以及部分磷脂的降解提高了二酰基甘油酰基转移酶（DGAT1）和磷脂二酰甘油酰基转移酶（PDAT1）的活性,增加了 TAG的合成。5.油脂合成相关的基因表达量的结果表明,三基因共调控下,乙酰辅酶A羧化酶（ACCD）和硫酯酶（FAT1）基因的上调增加脂肪酸的合成。四个DGAT2基因除了 DGTT1基因无表达量外,其余三个基因均上调,其中DGTT4上调了84%。C18:1是DGTT4优选底物。磷脂酸磷酸酶（PAP2）、PDAT1和DGAT1基因表达量均上调。这些基因的上调均增加了 TAG的合成。证实三基因调控策略可以减缓TCA循环的速度,降低脂肪酸的降解,使碳流量用于脂肪酸合成进而积累TAG。因此,本研究采用微藻多基因共调控的方式实现了对三基因LACS2-CIS1-DOF共调控,最终获得了提高油脂含量的工程藻。多基因共调控的方法在提高微藻产油上具有更高的潜力,为微藻产油提供了新的思路和基础。