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Micro RNA(mi RNA)是非常重要的转录水平基因表达调控因子,在植物生长发育和逆境中起重要调控作用,其调控作用不仅涉及植物组织器官的生长发育、免疫反应、激素调节等生物学过程,且参与植物对多种生物和非生物胁迫(干旱、盐渍、低温、营养等胁迫)的响应。小麦是重要的粮食作物,其生产遍布世界各地。严寒是限制黑龙江地区种植冬小麦的最主要原因,东农冬麦1号是黑龙江高寒地区首例能够安全越冬的强抗寒冬小麦品种,探讨mi RNA对其抗寒性的影响具有重要的理论和实践意义。目前,对mi RNA的逆境调控研究多集中在基因组测序的物种中。本研究以东农冬麦1号为材料,以实验室前期得到的6条寒胁迫下表达差异显著的mi RNAs为对象,在田间自然降温至5℃、-10℃、-25℃时,比较6个mi RNAs及其靶基因响应寒胁迫后表达模式的变化。克隆Pre-tae-mi R319并构建融合Pre-tae-mi R319的过表达载体,转化拟南芥并进行mi R319瞬时表达模式的检测。研究结果如下:(1)在田间自然降温至5℃、-10℃、-25℃时,实时荧光定量分析mi RNAs及其靶基因表达量显示:随着温度的降低,东农冬麦1号根茎中mi R319、1118、1120、1128、1133和1139表达量,呈先降后升的变化趋势,其靶基因表达量相反,表现为先升后降,表明mi RNA表达模式的改变与其靶基因的功能相关。上述3个低温中,-10℃时6条mi RNAs的表达量均达到最低值,-25℃时表达量显著增加;-10℃时其靶基因的表达量均达峰值,-25℃时显著降低。表明-10℃低温是东农冬麦1号中寒胁迫相关mi RNAs响应低温的温度转折点。(2)在线ps RNATarget软件预测低温胁迫后响应表达差异显著的上述6条mi RNAs的靶基因,共包含89个靶基因。从6条miRNAs中挑选出具有较强保守性的tae-mi R319,5′RACE(rapid amplification of cDNA ends)法验证tae-mi R319对其靶基因CBF转录因子(TC444396)的切割位点是tae-mi R319的5′末端第10个、第11个核苷酸之间、此作用位点位于TC444396编码区。(3)克隆东农冬麦1号Pre-tae-mi R319并插入植物表达载体,成功构建融合Pre-tae-mi R319的过表达载体p CMBIA230035Su后用花粉管通道方法转染拟南芥、获得过表达植株。对转化后拟南芥植株经4℃胁迫0h、24h、48h、72h后,检测叶片中mi R319及其靶基因的瞬时表达量,结果表明:4℃处理的0~72h内,mi R319表达量呈先增加后降低的趋势,4℃处理24h时miR319表达量达峰值;mi R319的靶基因在4℃处理的0~72h内表达量呈先降后升趋势、4℃处理48h时表达量最低。拟南芥中,mi R319响应低温胁迫、表达量先升后降,并负调控其靶基因的表达。推测冬小麦中mi R319响应低温、并通过对靶基因的调控,增强了冬小麦的抗寒性。