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研究背景骨质疏松症是一种以骨密度低、微结构受损、脆性骨折风险增加、老年人死亡率增加为特征的骨病。致残致死率高,严重影响患者的功能和生活质量,造成严重的社会和经济负担。破骨细胞与成骨细胞在骨骼的发育和形成过程中发挥着非常重要的作用,破骨细胞与成骨细胞功能活动与骨质疏松密切相关,二者功能相反,当破骨细胞活动过于活跃时则会加快骨质吸收,降低骨质密度,显著促进骨质疏松症发生发展。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）是一类长转录本,没有编码蛋白质的功能,在基因沉默和疾病进展中起着关键作用。近年来,lncRNA作为潜在的生物和病理调控因子受到了广泛的关注。LncRNA X染色体失活特异转录因子（Xist）只在失活X染色体的X失活中心表达,对X染色体失活的起始和扩散至关重要。LncRNAXist已被证实可以通过抑制骨髓间充质干细胞成骨分化来促进骨质疏松症的进展。据报道,lncRNAs可以通过作为miRNA的竞争性内源性RNA（competing endogenous RNAs,ceRNAs）来调节基因的表达,从而参与各种疾病的发生发展过程。我们通过采用LncBase Experimental v.2软件（http://carolina.imis.athena-innovation.gr/dianatools/web/index.php?r=lncbasev2%2Findex-experimental）进行生物信息学分析,发现在lncRNAXist序列上可能存在miR-590-3p的结合位点。此外,骨质疏松患者血清中miR-590-3p的浓度降低。然而,lncRNAXist是否可以通过miR-590-3p的ceRNA机制来调控骨质疏松发生发展过程中破骨细胞的分化尚不清楚。既往研究表明,TGF-β诱导的因子同位序列2（Tgif2）是破骨细胞分化调控因子之一,Tgif2的缺失可以抑制小鼠破骨细胞的分化和骨丢失。此外,Tgif2在各种疾病中可以被miRNA所调控。最近的一项研究表明,miR-34a可以通过靶向抑制Tgif2,抑制破骨细胞分化生成从而参与骨质疏松症的发展。我们通过microT-CDS 软件（http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=microTCDS/index）进行生物信息学分析发现,在Tgif2的3’-非翻译区上可能存在miR-590-3p的结合位点。然而,在破骨细胞分化过程中,Tgif2的表达是否可以通过miR-590-3p来调控尚未完全阐明。基于以上证据和生物信息学分析,我们拟研究lncRNAXist通过ceRNA机制与Tgif2竞争性结合miR-590-3p如何调节破骨细胞分化,进而影响骨质疏松发生发展的相关机制,为骨质疏松的研究及预防治疗提供一定的基础和贡献。第一部分LncRNAXist、miR-590-3p、Tgif2在卵巢切除小鼠股骨骨髓组织及破骨细胞中的表达目的:探究lncRNAXist、miR-590-3p和Tgif2在骨质疏松发展中的表达情况。方法:10周龄的野生型C57B/L6雌性小鼠切除双侧卵巢及周围脂肪组织以诱导骨质疏松（bilateral ovariectomy,OVX）,对照组小鼠仅切除周围脂肪组织（Sham）。手术5周后,处死小鼠,分离股骨及骨髓组织进行进一步检测。采用50ng/mL的小鼠重组RANKL（核因子κB受体活化因子配体）和100 ng/mL的小鼠重组M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）处理RAW264.7细胞以诱导破骨细胞分化。1.对小鼠股骨组织进行micro-CT扫描及统计骨表面密度（BS/TV）。2.采用qRT-PCR检测小鼠股骨骨髓组织中lncRNAXist、miR-590-3p的表达水平及Tgif2 mRNA的表达水平。3.对RAW264.7细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）染色,观察破骨细胞分化情况。4.采用qRT-PCR检测破骨细胞中lncRNAXist、miR-590-3p的表达水平及Tgif2 mRNA的表达水平。5.采用western blot检测破骨细胞中Tgif2蛋白的表达水平。结果:1.OVX组小鼠的骨表面积/组织体积（BS/TV）值低于假手术（Sham）组小鼠（P＜0.001）。2.与阴性对照组（NC）比较,OVX组小鼠股骨骨髓组织中lncRNA Xist和Tgif2 mRNA表达水平明显升高,而miR-590-3p的表达水平明显降低（P＜0.001）。3.与阴性对照组（NC）比较,Osteoclasts组中明显可见TRAP阳性细胞。4.与阴性对照组（NC）比较,Osteoclasts 组 lncRNA Xist 和 Tgif2 mRNA的表达水平升高（P＜0.001）,而miR-590-3p的表达水平显著降低（P＜0.05）。5.与阴性对照组（NC）比较,Osteoclasts组Tgif2蛋白表达水平明显升高。结论:在OVX小鼠股骨骨髓组织和破骨细胞中,lncRNAXist和Tgif2的表达水平上调,而miR-590-3p的表达水平下调。第二部分 干扰lncRNA Xist或过表达miR-590-3p抑制破骨细胞分化和Tgif2表达目的:研究lncRNAXist、miR-590-3p和Tgif2对破骨细胞分化的影响。方法:用 oe-Xist（Xist 过表达）、sh-Xist（干扰 Xist）或阴性对照（oe-NC 和 sh-NC）转染 RAW264.7 细胞,然后用 50 ng/mL RANKL 和 100 ng/mL M-CSF 刺激RAW264.7 细胞 7 天。1.采用 qRT-PCR检测 RAW264.7 细胞中 lncRNAXist、miR-590-3p 的表达及水平,Tgif2mRNA的表达水平。2.采用western blot检测RAW264.7细胞中Tgif2蛋白的表达水平。用 miR-590-3p-mimic（miR-590-3p 过表达）、miR-590-3p-inhibitor（miR-590-3p抑制剂）或阴性对照（mimic-NC和inhibitor-NC）转染RAW264.7细胞,然后用50 ng/mL RANKL 和 100 ng/mL M-CSF 刺激 RAW264.7 细胞 7 天。3.采用 qRT-PCR 检测 RAW264.7 细胞中 lncRNAXist、miR-590-3p 的表达水平及Tgif2 mRNA的水平。4.采用western blot检测RAW264.7细胞中Tgif2蛋白的表达水平。用 sh-Xist 或 miR-590-3p-mimic 转染 RAW264.7 细胞,然后用 50 ng/mL RANKL 和 100 ng/mL M-CSF 刺激 RAW264.7 细胞 7 天。5.对RAW264.7细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色观察破骨细胞分化情况。结果:1.过表达lncRNA Xist促进RAW264.7细胞中Tgif2 mRNA水平和蛋白水平（P＜0.001;P＜0.01）,干扰 lncRNAXist 抑制 RAW264.7 细胞中 Tgif2 mRNA水平和蛋白水平（P＜0.01）,但无论是过表达lncRNA Xist还是干扰lncRNA Xist对miR-590-3p表达均无显著影响。2.过表达miR-590-3p抑制RAW264.7细胞中lncRNAXist和Tgif2的表达（P＜0.001）,沉默 miR-590-3p 促进了 lncRNA Xist 和 Tgif2 的表达（P＜0.001;P＜0.01）。3.干扰lncRNAXist或过表达miR-590-3p抑制破骨细胞分化。结论:干扰lncRNAXist或过表达miR-590-3p抑制破骨细胞分化和Tgif2表达。第三部分 miR-590-3p 靶向 lncRNAXist 和 Tgif2目的:为了进一步探索 lncRNAXist 与 miR-590-3p 以及 miR-590-3p 与 Tgif2 之间的关系。方法:将Tgif2序列的野生型（WT）和突变的3’-UTR序列（mut）克隆到携带荧光素酶基因的pGL3载体中。然后将重组pGL3载体与miR-590-3p-mimic/inhibitor或阴性对照共转染到293T细胞或Osteoclasts中。1.当miR-590-3p过表达时,检测293T细胞中荧光素酶的活性。2.当miR-590-3p过表达或干扰时,检测Osteoclasts中荧光素酶的活性。将lncRNA Xist的野生型（WT）和突变的序列（mut）克隆到携带荧光素酶基因的pGL3载体中。然后将重组pGL3载体与miR-590-3p-mimic/inhibitor或阴性对照共转染到293T细胞或Osteoclasts中。3.当miR-590-3p过表达时,检测293T细胞中荧光素酶的活性。4.当miR-590-3p过表达或干扰时,检测破骨细胞中荧光素酶的活性。结果:1.在293T细胞中,过表达miR-590-3p降低了 pGL3-WT-Tgif2中荧光素酶活性（P＜0.05）,但对pGL3-mut-Tgif2荧光素酶活性无显著影响。2.在破骨细胞中,过表达miR-590-3p降低了 pGL3-WT-Tgif2中荧光素酶活性（P＜0.05）,干扰miR-590-3p则增强了 pGL3-WT-Tgif2中荧光素酶活性（P＜0.05）,但对pGL3-mut-Tgif2荧光素酶活性没有明显影响。3.在293T细胞中,过表达miR-590-3p降低了 pGL3-WT-Xist中荧光素酶活性（P＜0.05）,但对pGL3-mut-Xist荧光素酶活性无显著影响。4.在破骨细胞中,过表达miR-590-3p降低了 pGL3-WT-Xist中荧光素酶活性（P＜0.05）,干扰miR-590-3p则增强了 pGL3-WT-Xist中荧光素酶活性（P＜0.05）,但对pGL3-mut-Tgif2荧光素酶活性没有明显影响。结论:1.miR-590-3p可以与Tgif2结合并调控Tgif2的表达水平。2.miR-590-3p可以与lncRNAXist结合并调控lncRNAXist的表达。第四部分LncRNA Xist通过竞争性结合miR-590-3p促进破骨细胞分化目的:为了验证lncRNAXist是否通过与Tgif2竞争性结合miR-590-3p调控破骨细胞分化。方法:用 miR-590-3p mimic 转染或 oe-Xist 与 miR-590-3p mimic 共转染 RAW264.7细胞,然后用 50 ng/mL RANKL 和 100 ng/mL M-CSF 刺激 RAW264.7 细胞 7 天。1.采用 qRT-PCR检测 RAW264.7 细胞中 lncRNAXist、miR-590-3p 的表达及Tgif2mRNA的水平。2.采用western blot检测RAW264.7细胞中Tgif2蛋白的水平。3.对RAW264.7细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色,观察破骨细胞分化情况。结果:1.过表达miR-590-3p抑制破骨细胞中lncRNA Xist的表达及Tgif2的mRNA水平和蛋白水平（P＜0.05 or P＜0.001）,而同时过表达lncRNAXist则逆转了这一作用（P＜0.001）。2.过表达miR-590-3p抑制破骨细胞的分化,而过表达lncRNAXist则逆转了这一作用。结论:LncRNAXist通过ceRNA机制与Tgif2竞争性结合miR-590-3p上调Tgif2,进而促进破骨细胞分化。全文结论:1.在OVX小鼠股骨骨髓组织和破骨细胞中,lncRNAXist和Tgif2表达上调,miR-590-3p表达下调。2.干扰lncRNAXist或过表达miR-590-3p抑制破骨细胞分化和Tgif2表达。3.miR-590-3p 靶向 lncRNAXist 和 Tgif2。4.LncRNAXist通过ceRNA机制与Tgif2竞争性结合miR-590-3p促进破骨细胞分化。