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以程序性细胞死亡配体-1及其受体((programmed cell death 1/programmed cell death ligand 1,PD-1/PD-L1)为代表的免疫检查点阻断(immune checkpoint blockade)治疗是近年来新兴的一种治疗手段,受到广泛而深入的研究,也是肿瘤免疫治疗的热点之一。尽管在部分实体瘤患者身上取得了显著的治疗效果,但从整体而言,从PD-1/PD-L1治疗中受益的患者仍是少数。因为肿瘤细胞在免疫逃逸过程中还触发了其他多种免疫检查抑制点,如吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)。有研究表明双重阻断免疫检查点可以增强抗肿瘤免疫治疗作用,但是在目前协同递送两种免疫检查点阻断剂仍是一个挑战。本课题基于乳腺癌归巢和穿透性多肽构建了一种自组装的乳腺癌肿瘤靶向纳米递送系统,用于协同递送针对PD-L1的小干扰RNA(si RNA)——siPD-L1和IDO的抑制剂——1-甲基色氨酸(1MT),实现双重阻断免疫检查点,旨在提升抗肿瘤免疫治疗的目的。本课题主要分为三个部分。第一部分是共载免疫检查点阻断剂的多肽纳米胶束的构建。即胆固醇修饰的多肽单体的合成,和多肽单体构建共载免疫检查点阻断剂的靶向纳米胶束的特征考察,并对纳米胶束的结构和特征进行考察。首先采用固相合成法合成胆固醇修饰的16个氨基酸的多肽单体结构Chol-HHHHHHH-AKRGARSTA(CHL),然后通过高效液相色谱法对其进行纯化,用飞行质谱法进行分子量的鉴定。结果显示固相合成法成功合成了CHL单体,而后利用透析法让CHL在水中通过“自组装”的方式制备1MT-CHL,将1MT-CHL冻干后复溶制成1MT-CHL溶液,通过“共孵育”的方式将siPD-L1与1MT-CHL结合制备Co-CHL。最后分析测定Co-CHL的粒径、zeta电位,载药量和包封率,进行下步实验。第二部分是共载免疫检查点阻断剂纳米胶束的抗乳腺癌肿瘤细胞的体外研究。即在细胞水平研究共载免疫检查点阻断剂的纳米胶束Co-CHL的体外特征。以小鼠乳腺癌4T1细胞为研究对象,分别进行了细胞毒性,细胞摄取、胞内分布、内涵体逃逸及基因转染能力和犬尿氨酸生成抑制实验等研究。结果表明通过在载体CHL的介导作用下,siPD-L1在递送入胞的过程中避免被降解,实现内涵体逃逸,有效的实现基因的细胞转染,降低肿瘤细胞PD-L1的表达;而且细胞可以更多地摄取1MT,抑制肿瘤细胞内高表达的IDO的活力,减少犬尿氨酸的生成。而后在其基础上,在细胞水平构建了淋巴细胞-肿瘤细胞共培养的体系,通过不同的给药刺激,实验发现Co-CHL可以解除肿瘤细胞对淋巴细胞的免疫抑制,恢复淋巴细胞的肿瘤杀伤力。第三部分是共载免疫检查点阻断剂的纳米胶束抗乳腺癌的体内评价。即在4T1小鼠乳腺癌原位模型上,验证Co-CHL的体内分布、安全性和抗肿瘤作用。采用具有荧光的Di R制备Di R-CHL胶束,在活体成像仪下指示CHL胶束的体内的分布情况,结果显示纳米胶束主要集中在肿瘤部位,而主要脏器的荧光也极少,说明纳米胶束在小鼠体内具有较强的肿瘤组织靶向性。肿瘤生长抑制实验表明,在实验条件下Co-CHL可以起到显著的肿瘤抑制作用,而H&E染色结果表明纳米胶束的毒性低,安全性高。在此基础上对Co-CHL的抗肿瘤免疫机制进一步进行研究,研究发现肿瘤浸润淋巴细胞中CD8+/CD4+比例显著升高,而肿瘤组织的IL-2和IFN-γ水平也有显著提高。本研究构建了共载两种免疫检查点阻断药物的多肽胶束CHL,CHL可以特异性地积聚在乳腺癌的肿瘤部位,并且siPD-L1在CHL的介导下被肿瘤细胞内吞后,可以实现内涵体逃逸,进行转染。同时,递送入胞的药物1MT会阻止色氨酸代谢。靶向释放的siPD-L1和1MT有助于细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTLs)的存活和激活,导致乳腺癌细胞凋亡。体外实验和小鼠体内实验结果表明,具有共载两种免疫检查点的多肽胶束,可以有效的抑制乳腺癌肿瘤细胞的生长。因此,这项研究可以为乳腺癌的免疫治疗提供了一种的借鉴与参考。