植物雄性不育突变体是一种宝贵的种质资源,可作为研究植物生殖发育和利用不育化生产杂交种子的重要材料。本研究以来源于辐射诱变的玉米细胞核雄性不育突变体K305ms姊妹交群体(由可育株K305F和不育株K305ms构成,F代表可育株;M代表不育株)为材料,通过细胞学观察,明确K305ms的败育时期和特征;利用RNA-seq测序,比较K305F与K305ms花药三个发育时期(花粉母细胞时期、二分体时期和四分体时期;分别用A、B和C代表)的差异表达基因(DEGs),利用生物信息学方法分析与K305ms败育有关的代谢途径,并通过qRT-PCR检测相关基因的表达量差异,探讨其败育机理,为后续研究应用提供理论依据。主要研究结果如下:1.采用卡宝品红和1%醋酸洋红染色观察发现,K305ms花粉母细胞形态为椭圆形,能完成减数分裂过程,但细胞质不均等分裂,形成的二分体和四分体形态异常,小孢子畸形并逐渐解体消失,无法发育产生功能花粉;败育时期为小孢子时期。2.石蜡切片和扫描观察结果表明,K305ms花药组织具有正常的四层体壁细胞,在减数分裂结束后开始出现明显败育特征,绒毡层随药室里的小孢子一起异常解体,花药腔出现凹陷,花药壁其余细胞层皆无完整的细胞核结构,花药表皮细胞萎缩变小并存在局部残缺,无网纹状蜡质结晶结构。其败育特征与已报道的ms32等其它玉米细胞核雄性不育突变体有明显区别。3.通过Illumina HiSeqTM2000测序平台对可育株和不育株3个发育时期的花药进行转录组测序分析,每个样品鉴定到3万个左右转录本(近10%为新转录本)、5-6万个可变剪接和10-14万个SNPs。利用NOIseq整合三次生物学重复的数据,以FDR≤0.001和|log2(表达量差异倍数)|≥1为标准对基因的表达量进行差异分析,结果显示FAvsMA上调451个,无下调,FBvsMB上调66个,下调16个,FCvsMC上调1173个,下调262个。其中,3个时期共表达的DEGs有34个,仅GRMZM2G133718(丝氨酸羧肽酶)表达量可育株低于不育株,其余33个基因表达量可育株均高于不育株。4.GO富集分析显示,可育株与不育株3个时期的DEGs,注释在细胞组分中分别有219、42和817个,主要包括细胞、细胞部分、细胞器、细胞膜和大分子复合物等;注释在生物学过程中分别有216、48和856个,包括代谢过程、细胞过程、刺激响应和生化过程调节等;注释在分子功能中分别有221、45和832个,包括结合、催化活性和转运活性等。5.KEGG代谢通路富集分析表明,3个时期共有18788个基因被成功定位到不同代谢途径中。其中,K305F与K305ms相比,A时期165个DEGs被定位到75条代谢途径,包括次生代谢物合成和代谢途径、苯丙素合成、淀粉和蔗糖代谢等;B时期31个DEGs被定位到31条代谢途径,主要有次生代谢物合成和代谢途径、苯丙素合成和植物激素信号传导等;C时期685个DEGs被定位到97条代谢途径,包括苯丙素合成、植物激素信号传导、氨基酸合成或降解、脂肪酸合成、次生代谢物合成、不饱和脂肪酸合成、淀粉和蔗糖代谢等。推测苯丙素合成、次生代谢物合成、糖类代谢和脂类代谢等途径与K305ms败育密切相关。6.进一步分析富集于脂类物质代谢途径(不饱和脂肪酸合成、脂肪酸合成、脂肪酸代谢、脂肪酸延长与角质、软木脂和蜡质合成)的DEGs,这些DEGs注释为细胞色素P450蛋白家族、羰基还原酶、转移酶活性、酰基去饱和酶、乙醛脱氢酶和酮乙基辅酶A合成酶等。这些基因在3个时期的表达模式不同,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了部分候选基因的相对表达量,表达模式与转录组测序结果吻合。7.综合细胞学观察和转录组测序分析结果,推测K305ms花药与发育相关的代谢网络中的部分基因表达量不足,从而使其在物质合成、生化代谢以及能量传输中出现异常,导致雄配子形态和发育过程异常;同时,花药中脂类物质代谢途径发生异常,导致花药壁的绒毡层异常降解,小孢子无法形成花粉壁,最终解体消失。两者可能是导致K305ms败育的主要原因。