【目的】乌头碱（Aconotine）是乌头属植物所含生物碱的主要成分,具有广泛的药用价值。但其治疗剂量与致死剂量接近,中毒时可因严重的心律失常而致死。乌头碱毒理、药理学机制错综复杂,其心脏毒性机制尚不明确。心律失常的临床表现多样,病因复杂。钙离子在机体的各项功能调控、特别是细胞水平上扮演重要的角色,细胞膜及肌浆网上钙调蛋白种类多、各自具有不同的功能,受到各种信号通路复杂的调节。受磷蛋白（phospholamban,PLN）是细胞中调节钙离子平衡的重要蛋白,它通过磷酸化修饰改变自身与肌浆网钙离子-ATP酶（sarco（endo）plasmic reticulum calcium-ATPases2a,SERCA2a）的结合,从而调控SERCA2a的功能。因为SERCA2a是肌浆网上唯一能够重吸收细胞质中钙离子的蛋白,故PLN磷酸化对细胞内钙离子平衡发挥重要作用。现在针对心肌细胞钙平衡紊乱的研究主要集中在临床医学领域,多为从心源性疾病（如心肌肥厚、心肌梗死、心肌缺血再灌注等）的角度出发对PLN蛋白进行探究,但是在法医学和毒理学方面,特别是乌头碱对细胞钙离子调节紊乱的研究这一方面,尚缺乏相应的深入探索。之前的研究已明确,乌头碱染毒能引起细胞内钙平稳紊乱,导致钙超载现象。本课题的研究目的是探讨PLN磷酸化是否在乌头碱引起的钙平衡紊乱中发挥作用。因前期课题组使用原代培养的大鼠心室肌细胞等进行实验过程中,PLN蛋白丰度低,其磷酸化蛋白表达丰度更低,Western-blot检测时条带较淡,背景干扰强,磷酸化状态蛋白检测无法满意完成,故系统深入地研究乌头碱对PLN磷酸化状态的影响及其机制的探索遇到了瓶颈。因此,本课题组前期应用Flp-In系统构建了能够稳定表达人源性PLN蛋白的TRex293细胞系,命名为hPLN-293细胞（相关论文正在发表编校阶段）,该细胞系在多西环素（Doxycyline,Dox）的诱导下可过表达PLN蛋白,且细胞系可增殖,便于观察药物干预对PLN磷酸化状态的影响,并进行其细胞毒理学机制研究。本研究具体完成以下实验目的:（1）对第1、5、10代hPLN-293细胞进行PLN诱导表达,检测该细胞表达PLN的稳定性;（2）通过采取不同浓度、不同时间染毒来观察乌头碱导致的细胞形态学改变情况,并应用CCK8法测乌头碱对细胞的活性影响,从而确定适合后续实验的染毒条件;（3）检测乌头碱染毒对细胞钙离子浓度的影响;并探索乌头碱对PLN蛋白及其Thr17位点、Ser16位点磷酸化状态的影响,以及其上游磷酸化酶——钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（Calcium/Calmodulin-Dependent Protein KinaseⅡ,Ca MKⅡ）和蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）的磷酸化状态的变化,进一步探究乌头碱的细胞毒性机制。【方法】（1）构建了hPLN-293细胞系,并检测其过表达PLN的稳定性:用加入Dox与未加Dox培养的细胞做对照,选用传代培养第1、5、10代hPLN-293细胞,加入Dox诱导使之过表达转入的人源性PLN蛋白,采用Western-blot蛋白印记法检测PLN表达量,并比较组间差异。并以未加Dox诱导组为对照。（2）利用hPLN-293细胞观测乌头碱干预后的细胞毒效应:加入Dox诱导的细胞培养至六孔板,分别用不同浓度的乌头碱（0、0.5、1、10、100μmol/L）作用于细胞不同时间（0、1、2、4小时）,用CCK8法检测不同浓度及时间给乌头碱干预后细胞的活性,并比较每组的细胞形态差异。（3）观察染毒前后细胞内钙离子含量的改变:用Fluo-3标记钙离子,在激光共聚焦扫描显微镜下可以被激发出绿色荧光。细胞染毒前后的荧光强度即可反映乌头碱染毒前后细胞内钙离子浓度的改变。（4）利用Western-blot法检测（1）乌头碱染毒对PLN总蛋白、SERCA2a总蛋白表达量影响,（2）PLN第16位丝氨酸（Ser16-PLN）及其上游磷酸化酶蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）的磷酸化状态变化,（3）PLN第17位苏氨酸（Thr17-PLN）及其上游磷酸化酶钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin-dependent kinaseⅡ,Ca MKⅡ）的磷酸化状态变化,以及（4）PKA及Ca MKⅡ抑制剂干预对乌头碱染毒造成的PLN蛋白磷酸化影响的改变。【结果】（1）在加入诱导剂Dox后,该细胞系PLN蛋白表达丰度显著提高,便于其磷酸化蛋白的检测与分析。细胞能够稳定表达PLN蛋白并且不受传代次数的影响。（2）乌头碱（1μmol/L）干预细胞可造成钙超载。10μmol/L及100μmol/L乌头碱干预后细胞活性下降,形态学改变随着乌头碱作用于细胞时间的延长而明显;0.5、1μmol/L的乌头碱干预后细胞形态未见显著变化。实验最终采用乌头碱（1μmol/L）染毒2小时进行后续实验。（3）乌头碱染毒后,细胞内PLN、SERCA2a总蛋白表达量均升高,Ser16-p-PLN及其上游p-PKA的磷酸化均降低;Thr17-p-PLN及其上游p-Ca MKⅡ磷酸化也降低;乌头碱引起Ser16位磷酸化水平降低相对Thr17位更明显;PKA及Ca MKⅡ抑制剂干预后再进行乌头碱染毒,造成的PLN蛋白磷酸化降低更显著的改变。【结论】构建的hPLN-293细胞具有良好的PLN蛋白表达丰度和稳定性,可用于PLN磷酸化研究的细胞学实验。乌头碱（1μmol/L）染毒造成细胞内钙超载,同时引起PLN和SERCA2a蛋白含量反馈性增加。乌头碱可能通过抑制PKA-Ser16-PLN及Ca MKⅡ-Thr17-PLN磷酸化途径,降低PLN的磷酸化状态（对Ser16-PLN磷酸化影响更明显）,从而增加PLN对SERCA2a的抑制作用,导致SERCA2a重吸收钙离子能力下降,引起细胞质内钙超载。