前言膀胱癌在我国是泌尿外科最常见的恶性肿瘤。表浅膀胱癌容易复发，而侵袭性膀胱癌或有转移者预后不佳。虽然手术技巧和化疗方案不断进步，但膀胱癌的治疗目前仍不十分满意。因此有必要深入了解膀胱癌的机制，以期为膀胱癌的治疗提供新的尝试。目前研究认为DNA甲基化导致基因表达变化是肿瘤形成的重要原因，DNA甲基化改变是除缺失与突变之外的第三种调控基因表达的机制，基因启动子区域的甲基化是抑癌基因失活的主要机制之一。Ras相关区域家族1A（RASSF1A）是2000年从3号染色体短臂（3p21.3）上克隆出来的新型候选抑癌基因。已有研究表明RASSF1A是人类肿瘤中经常失活的抑癌基因，在正常组织中极少发生RASSF1A基因甲基化，而在肿瘤组织甲基化率可达90％以上。某些发生RASSF1A基因甲基化的癌前病变患者，后被证实发展成癌。了解膀胱癌RASSF1A基因甲基化特征和规律，对加深膀胱癌变机制的了解以及对膀胱癌高危人群预警和早期诊断生物学指标的建立均具有重要意义。本研究采用半定量RT-PCR和甲基化特异性PCR（MSP）检测正常膀胱组织及膀胱癌组织中RASSF1A基因的表达及其启动子甲基化的状态，探讨RASSF1A基因的表达与膀胱癌生物学行为间的关系。5-氮-2’-脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR）是一种特异性甲基转移酶抑制剂，通过去甲基化作用可使多种CpG岛高甲基化的抑癌基因重新表达，恢复抑癌功能。本研究同时以膀胱癌BIU87细胞系为研究对象，以不同浓度的5-Aza-CdR作用于BIU87细胞，观察5-Aza-CdR对BIU87细胞凋亡的影响，同时研究5-Aza-CdR对膀胱癌BIU87细胞RASSF1A基因表达的影响，为膀胱癌的治疗提供新的探索。材料和方法1、临床资料：30例冷冻膀胱癌组织标本来自中国医科大学盛京医院泌尿外科2005年1月至2006年8月手术治疗的膀胱癌患者，10例正常膀胱组织标本来自同期前列腺增生症行开放手术患者。30例患者中男24例，女6例，年龄28～84岁，平均年龄55.6岁。肿瘤组织经病理组织学证实，均为膀胱移行细胞癌。膀胱癌临床分期按照1997年UICC分期标准：T_a2例，T₁10例，T₂14例，T₃2例，T₄2例。病理分级按照WHO分级标准：G₁8例，G₂14例，G₃8例。BIU87人膀胱癌细胞系购自北京大学泌尿外科研究所。2、实验方法（1）RASSF1AmRNA表达的检测提取30例膀胱癌组织及10例正常膀胱组织总RNA，采用半定量RT-PCR检测膀胱癌组织及正常膀胱组织中RASSF1AmRNA的表达。（2）RASSF1A基因异常甲基化状态的检测提取30例膀胱癌组织及10例正常膀胱组织基因组DNA，采用甲基化特异性PCR（MSP）检测膀胱癌组织及正常膀胱组织中RASSF1A基因启动子甲基化状态。（3）5-Aza-CdR诱导膀胱癌BIU87细胞凋亡的检测以不同浓度的5-Aza-CdR作用于膀胱癌BIU87细胞，AO荧光染色对细胞凋亡形态观察，MTT法检测细胞增殖程度及采用AnnexinV-FITC／PI双染流式细胞术检测5-Aza-CdR对BIU87细胞凋亡的影响。（4）5-Aza-CdR对膀胱癌BIU87细胞RASSF1A基因表达的影响以不同浓度的5-Aza-CdR作用于膀胱癌BIU87细胞，采用半定量RT-PCR和甲基化特异性PCR（MSP）检测5-Aza-CdR对膀胱癌BIU87细胞RASSF1A基因表达的影响，同时应用Western blot测定5-Aza-CdR对膀胱癌BIU87细胞RASSF1A蛋白的表达的影响。3、统计方法所有数据均用有SPSS12.0统计软件进行处理，P＜0.05为统计学上差异有显著性。结果1、膀胱癌组织中RASSF1AmRNA表达10例正常膀胱组织中只有1例RASSF1AmRNA表达缺失，而30例膀胱移行细胞癌标本中17例RASSF1AmRNA表达缺失，膀胱癌组织与正常膀胱组织RASSF1AmRNA表达率之间差异显著（P＜0.05）。RASSFlAmRNA表达率在膀胱癌组织病理分级中差异无统计学意义（P＞0.05），但在表浅膀胱癌T_a-T₁（12／12）与侵润性膀胱癌T₂-T₄（1／18）中差异显著（P＜0.05）。RASSF1AmRNA表达水平在膀胱癌病理分级和临床分期中差异无统计学意义（P＞0.05）。2、膀胱癌组织中RASSF1A基因的甲基化状态10例正常膀胱组织中只有1例RASSF1A基因甲基化，而30例膀胱移行细胞癌标本中21例检测到甲基化，膀胱癌组织与正常膀胱组织甲基化率之间差异显著（P＜0.05）。RASSFlA基因甲基化发生率在膀胱癌病理分级中差异无统计学意义（P＞0.05），但在表浅膀胱癌T_a-T₁（4／12）与侵润性膀胱癌T₂-T₄（17／18）中差异显著（P＜0.05）。3、5-Aza-CdR诱导膀胱癌BIU87细胞凋亡的检测结果BIU87细胞经不同浓度5-Aza-CdR处理后，细胞生长速度受到不同程度抑制，随着5-Aza-CdR浓度增加抑制作用增强，细胞的存活率降低，细胞凋亡率逐渐增高，处理组与对照组相比差异显著（P＜0.05）。细胞凋亡率与5-Aza-CdR浓度水平具有剂量依赖关系（P＜0.05）。AO荧光染色后5-Aza-CdR处理组可见部分细胞出现核染色质边集、固缩、断裂成数个黄绿色强荧光颗粒等凋亡的特征性形态学改变。4、5-Aza-CdR对膀胱癌BIU87细胞RASSF1A基因表达的影响以GAPDH作为内参照，RT-PCR检测对照组BIU-87细胞未见RASSF1A基因的mRNA表达，分别用浓度0.51μmol／L、1.0μmol／L、5.0μmol／L 5-Aza-CdR处理细胞后，BIU-87细胞RASSF1AmRNA的相对表达量分别为：0.73+0.05，1.39±0.03，1.76±0.02，各处理组RASSF1AmRNA的相对表达量差异有显著性（P＜0.05）。细胞给予5-Aza-CdR处理后，RASSF1A基因甲基化程度被逆转。经不同浓度5-Aza-CdR处理后，各组细胞RASSF1A蛋白重新表达，0.5μmol／L、1.0μmol／L、5.0μmol／L 5-Aza-CdR处理组RASSF1A蛋白相对表达量分别为0.49±0.01，0.99±0.05，1.22±0.07，三个5-Aza-CdR处理组RASSF1A蛋白的相对表达量差异有显著性（P＜0.05）。结论RASSF1A基因启动子在膀胱癌中发生异常甲基化导致RASSF1AmRNA表达下调。RASSF1A基因失活可能是膀胱癌发病重要机制。体外细胞实验结果提示5-Aza-CdR可能通过对RASSFIA基因的再表达而抑制肿瘤细胞的生长，从而诱导膀胱癌BIU87细胞凋亡的增加。膀胱癌BIU87细胞RASSF1AmRNA表达下调由于基因启动子区域高甲基化所致，RASSF1A基因具有抑制肿瘤细胞生长的功能，其可能参与了膀胱癌的发病机制。