应用聚合酶链反应单链构象多态性分析技术检测微量残留急性髓细胞白血病的研究

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聚合酶链反应(PCR)是一种体外扩增目的基因片段技术,这种技术可在几小时内将目的基因片段扩增107-108倍。单链构象多态性分析(SSCP)是一种聚丙烯酰胺电泳技术,此方法根据核酸分子的构象差异可以将相差一个碱基的单链DNA或RNA片段分离开。 我们应用PCR-SSCP技术对急性髓细胞白血病(AML)患者的N-ras基因点突变进行了筛选,并对突变患者进行临床完全缓解(CR)后的随访检测。 首先应用二次PCR-SSCP方法对N-ras基因点突变为微量残留白血病细胞(MRLC)检测标志的敏感度进行了测定。HL-60细胞系具有N-ras 61位密码子点突变,将其DNA与正常人DNA进行系列稀释,第一次PCR进行50μl体系的非同位素对称PCR,SSCP后将突变位置单链凝胶切下进行电洗脱。洗脱后再取5μl模板进行第二次同位素不对称扩增,PCR后再次SSCP。此方法的MRLC检测敏感度为10-6。第二次PCR时,将与突变单链来自同一引物延伸所得正常单链连续用水稀释,也取5μl进行同位素不对称PCR。此正常单链的稀释度(指数形式)与相应区带的密度扫描值近似直线关系,以此为标准曲线。第二次SSCP后,相同稀释度(用正常人DNA稀释)HL-60 DNA单链的密度扫描值与标准曲线相差不到2倍。 对17例AML患者进行了包括12/13位密码子的突变筛选,其中5例阳性(29%);对51例AML患者进行了包括61位密码子的突变筛选,其中13例阳性(26%)。总突变率55%,有1例复合突变。 对2例61位密码子片段阳性者进行了完全缓解(CR)后MRLC检测。1例3疗程后MRLC为10-4,6-7疗程后MRLC在10-6以下,说明随着疗程数的增加,
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