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双生病毒是一种呈孪生颗粒形态的植物单链环形DNA病毒,至今已在多个国家和地区的多种作物上造成毁灭性危害。自20世纪90年代起,在我国华南地区的作物及杂草上己相继发现了多种双生病毒。本文报告了福建省几种作物和杂草上的双生病毒的分子鉴定结果。从福建福州采集了八份表现矮化症状的普通烟样品,利用双生病毒特异性引物PA/PB扩增得到约500bp的DNA-A部分片段的相似性高于95%。挑选分离物F3进一步进行DNA-A全序列测定,结果显示F3 DNA-A(F3A)全长为2739 nts(EF125190)。利用RCA鉴定出DNA-B分子,F3 DNA-B(F3B)全长是2720 nts(FJ874926)。核苷酸同源性比对发现,F3A与海南报道的苎麻花叶病毒的一个分离物(Ramie mosaic virus,RaMoV,EU596959)相似性最高,为95.1%。因此,我们认为F3是RaMoV的一个分离物。这是首次有关RaMoV自然侵染烟草的报道。为进一步验证RaMoV F3分离物的致病性,我们构建了F3A和F3B的侵染性克隆。农杆菌接种实验发现,F3A单独能完成系统侵染本氏烟、普通烟、珊西烟、心叶烟、三生烟和番茄,但是不能诱导任何症状。混合接种F3 A+B,可在本氏烟、普通烟、珊西烟和三生烟上诱导产生典型的双生病毒侵染症状。从福建福州烟田采集的表现曲叶、耳突、叶脉增厚和矮化症状的普通烟样品YC7中分离出F11和F12两种病毒。利用双生病毒特异性引物PA/PB扩增得到约500bp的DNA-A部分序列,确定YC7为F11和F12不同病毒复合侵染。F11和F12全长分别是2741 nts(FJ869907)和2754 nts(FJ869908)。同源性比对发现,F11与报道的广东番木瓜曲叶病毒的分离物PaLCuGuV-[CN:Gd2:02](AJ558122)的核酸相似性最高,为97.3%;F12与胜红蓟黄脉病毒的台湾分离物AYVVTW-[TW:Tai:99](AF307861)的核酸相似性最高,为90.1%。利用引物β01/02找到F12的伴随卫星DNAβ(F12β),F12β全长1344 nts(FJ869909),与胜红蓟黄脉病毒台湾分离物伴随卫星AYVB-[TW:CHu:02] (AJ542495)相似性最高,96.5%,说明F11和F12分别是PaLCuGuV和AYVV的一个分离物。以样品YC7为毒源,利用粉虱进行传毒,能在普通烟和心叶烟上引起曲叶、耳突、叶脉增厚和矮化症状。PCR检测表明,传毒烟草上存在F11和F12两种病毒和F12β分子。Fp1-Fp4分离物来自福建福州表现轻微的花叶和皱缩症状的圆叶矮牵牛。利用双生病毒特异性引物PA/PB扩增,得到约500bp的DNA片段,它们间的的核苷酸相似性为97.5%,说明它们是同一种病毒的不用分离物。随机选择Fp1进行全序列测定及进一步分析。Fp1全长2828 nts(FJ515896),具有典型的双生病毒DNA-A的基因组结构。Fp1DNA-A全序列与中国江苏报道的番薯曲叶病毒的一个分离物SPLCV-[CN-Js:08](FJ176701)相似性最高,为92.1%,说明Fp1是SPLCV的福建分离物。据我们所知,这是首次报道SPLCV可以自然侵染圆叶矮牵牛。通过构建SPLCV Fp1分离物的侵染性克隆,并进行致病性测定,结果表明,Fp1A不能侵染本氏烟。从福建漳州采集到表现明显黄脉症状的一点红(Fz1-Fz5)和野茼蒿(Fz6)等六个样品。从这些植物的叶片中提取总DNA并采用滚环复制扩增法检测。Fz1-Fz6扩增产物分别用限制性内切酶BamH I、EcoR I、Kpn I、Sac I、Xba I和Sal I处理。Fz1-Fz6酶切片段(EcoR I切下的2.7 kb,Xba I切下的1.3 kb)被测序,部分结果显示这些植物被同一种病毒侵染。选择Fz1进行进一步分析。Fz1全长2725 nts(EU377539),伴随的DNAβ全长1337 nts(FJ869906)。Fz1全序列与印度的夜香牛黄脉病毒分离物VeYVV-[IN:Mad:05] (AM182232)的相似性最高,76.7%。根据双生病毒“种”的分类标准,Fz1是一个双生病毒新种,我们将这个双生病毒新种命名为一点红黄脉病毒(Emilia yellow vein virus,EmYVV)。我们还构建了EmYVV及其伴随DNAβ的侵染性克隆,致病性测定表明,Fz1DNA-A可以单独侵染本氏烟并诱导产生轻微的曲叶症状。Fz1DNA-A+ DNAβ能侵染本氏烟并诱导产生典型的曲叶症状。从福建地区表现黄色花叶症状的大青样品(Fz7-Fz9)上分离到双生病毒。利用简并引物PA/PB对三个分离物进行扩增,获得的约500bp片段的DNA序列,其相似性为99.54%。随机选择分离物Fz7进行病毒全长基因组的扩增和序列测定。结果表明,Fz7 DNA-A全长2776 nts(FJ011668),与重瓣臭茉莉金色花叶病毒(ClGMV)相似性最高,达82%,是一新型的双生病毒,命名为中国大青黄色花叶病毒(Clerodendrum yellow mosaic China virus,ClYMCNV)。从Fz7中发现有DNA-B分子,全长2739 nts(FJ011669),证实ClYMCNV是一个新的双组分双生病毒。ClYMCNV侵染性克隆的构建为后来的致病性测定做好了准备。通过PCR扩增获得了RaMoV八个功能蛋白的基因AV1、AV2、AC1、AC2、AC3、AC4、BV1和BC1基因。将BV1构建到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7上,把AV1、AV2、AC1、AC2、AC3、AC4、BV1和BC1构建到捕获载体pGADT7上,通过筛选鉴定获得了重组子pGBK-BV1、pGAD-BV1、pGAD-BC1、pGAD-AC1、pGAD-AC2、pGAD-AC3和pGAD-AC4。将上述重组子分别单独转化到酵母菌AH109中,转化产物涂布不同营养缺陷型培养基,检测八个蛋白对酵母细胞的毒性和自激活活性,结果表明,RaMoV八个蛋白对酵母菌AH109都未表现出毒性和自激活活性。将重组子pGBK-BV1与所有pGAD-X重组子两两共转化到酵母菌AH109中,转化产物涂布不同营养缺陷型培养基,从而检测RaMoV BV1自身互作及BV1与其它七个蛋白之间的互作情况。结果显示, BV1分别与AV2、AC3和BC1之间被检测到互作现象。“本氏烟”文库质量鉴定结果表明:文库初始文库滴度分别为3.1×107 cfu/mL,扩增文库滴度为3.4×107 cfu/mL。文库重组率均大于95%,“本氏烟”文库cDNA插入片段长度集中分布在900-1000 bp之间。该文库可以用于配合实验进行文库筛选。将重组子pGBKT7-BV1单独转化到酵母菌Y187中,转化产物涂布不同营养缺陷型培养基,检测BV1蛋白对Y187细胞的毒性和自激活活性。结果表明,BV1蛋白对酵母菌Y187都未表现出毒性和自激活活性。所以,我们将Y187 ( pGBKT7-BV1 )和AH109 (pGADT7-cDNA)进行配合,配合产物涂布不同营养缺陷型培养基,筛选可能与诱饵蛋白BV1互作的寄主蛋白。结果表明,以BV1为诱饵,从本氏烟文库中筛选到八个阳性克隆。PCR鉴定阳性克隆子中cDNA插入片段的大小,将含有不同长度插入片段的酵母质粒分别转化到大肠杆菌DH5α中,经测序,并在GenBank数据库中对测序结果进行blast比对,根据同源序列的注释信息,发现BV1蛋白与烟草SnRK1和DXR两个蛋白发生互作,其机理和功能有待进一步探讨。