组蛋白修饰是近年来研究较多的一种表观遗传调控,包括组蛋白残基的甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和Sumo化等,在多种生物学过程中发挥重要作用。组蛋白乙酰化通常发生在组蛋白H3或H4的赖氨酸残基上,通过中和组蛋白所带的正电荷而减弱DNA与组蛋白的结合,有利于转录起始复合物与DNA结合,从而促进基因的转录。组蛋白乙酰化状态由两种作用相反的酶一组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferases,HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)调控,其中组蛋白乙酰化由HATs催化完成,去乙酰化则由HDACs介导。目前共发现18种组蛋白去乙酰化酶,大体可以分为四类,其中Ⅰ类包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8。HDAC1与HDAC2具有重叠互补功能,两者以二聚体的形式共同存在于SIN3, NuRD及CoREST复合物中。有研究证明HDAC参与调控细胞周期进展,同时缺失HDAC1和HDAC2的细胞出现衰老样改变,并伴有p21和p57的上调。CRLs (Cullin-RING Ubiquitin E3Ligases)是目前已知的最大的一类泛素连接酶,参与细胞周期,信号转导,生长发育及DNA损伤修复等生命过程。Cullin家族作为复合物中的支架蛋白,在人类细胞中包括8个成员,即CUL1, CUL2, CUL3, CUL4A, CUL4B, CUL5, CUL7以及PARC,每个成员通过其N末端与衔接蛋白相连进而结合底物,C末端通过RING蛋白结合活化的E2,并将结合在E2上的泛素分子转移到底物上。其中CUL4以DDB1做为衔接蛋白,通过底物受体蛋白(DCAFs)识别并结合靶蛋白后将其泛素化。近年来的研究表明,CUL4参与DNA甲基化、异染色质形成和组蛋白甲基化等表观遗传调控过程。CUL4在高等生物中包括CUL4A和CUL4B两个成员,其中CUL4B在N端比CUL4A多了150个氨基酸,这些氨基酸中含有入核信号,因而两者亚细胞定位不同,CUL4B主要定位于细胞核,而CUL4A主要定位于细胞质。由于CUL4B主要定位于细胞核,近年来更多的研究关注CUL4B所具有的独特的转录调控作用,如CUL4B可以泛素化降解H3K4甲基化酶WDR5,在神经系统发育过程中发挥重要作用；CUL4B通过抑制miR-372及miR-373促进CDK2表达,正向调控细胞周期的进展；CUL4B催化H2AK119单泛素化,并协同PRC2或SUV39H1/HP1/DNMT3A复合物,通过促进组蛋白和DNA甲基化,抑制抑癌基因表达,从而促进肿瘤的发生发展。本实验室前期研究发现,全身性敲除Cul4b基因引起小鼠胚胎期致死,胚胎细胞增殖减少、凋亡增加。为理解CUL4B在小鼠胚胎发育中的作用机制,本研究以小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)为研究对象,系统分析了CUL4B在调控细胞周期进展中的作用及其机制。第一部分Cul4b敲除小鼠MEF获得及表型分析如前所述,全身性敲除小鼠Cul4b基因导致小鼠在胚胎期E8.5至E9.5天之间死亡,限制了利用全身性敲除小鼠进行研究。为此,本研究利用Sox2-Cre和CAG-Cre/Ersl转基因小鼠与Cul4b条件性敲除小鼠交配,获得MEFs。1、用实验室前期构建的Cul4bflox/flox小鼠(在Cul4b第2内含子和第5内含子中各插入一个loxp位点,在Cre酶作用下将第3到第5外显子切除,从而达到Cul4b基因敲除的目的)与Sox2-Cre小鼠或CAG-Cre/Ersl小鼠交配,得到Cul4b全身敲除的小鼠。于E13.5-E14.5天时取MEFs细胞,并对其进行基因型鉴定,选取野生型(wild type, WT)和Cul4b敲除的MEFs细胞进行传代培养。2、通过实时定量和Western blot对两种基因型的MEF细胞分别在mRNA和蛋白水平进行敲除效果验证,证明在该模型中Cul4b被敲除而Cul4a未发生改变。3、本实验室前期研究发现,CUL4B干扰后细胞增殖减慢,出现S期阻滞,说明CUL4B在细胞周期中发挥重要作用。为此,我们取野生型及Cul4b敲除小鼠的MEFs进行传代培养,并从以下方面对其表型进行观察分析。1)前期研究发现杂合子个体内表达CUL4B突变等位基因的细胞处于选择劣势。为明确CUL4B对MEFs的影响,我们将两种基因型(野生型及Cul4b敲除型)的MEFs细胞等比例混合进行传代培养,分别收取第一代、第二代和第三代的细胞进行免疫荧光检测CUL4B表达阳性的细胞并对其进行统计分析,结果发现随着传代次数的增加,CUL4B阳性细胞比例逐渐增加,说明Cul4b敲除的MEFs细胞增殖受到限制,处于选择劣势。2)采用MTT及EdU实验对比分析野生型和Cul4b基因敲除的MEFs细胞增殖情况发现,Cul4b敲除后细胞的增殖明显减慢。3)采用流式技术对野生型和Cul4b基因敲除的MEFs细胞进行细胞周期分析,结果发现Cul4b敲除的MEFs细胞出现G1期累积,同时伴有S期和G2期减少。4)通过免疫荧光对细胞骨架进行染色,发现Cul4b敲除的MEFs细胞出现细胞核变大、细胞形态呈扁平、不规则变大的衰老样改变。SA-βgal染色亦发现Cul4b敲除的MEFs细胞衰老增加。5)采用Tunel检测方法对野生型和Cul4b基因敲除的MEFs细胞进行分析未检测到细胞凋亡差异。综上所述,利用两种Cre转基因小鼠我们成功获得了Cul4b基因敲除的MEFs,通过增殖、衰老和凋亡分析我们发现,缺失CUL4B导致细胞增殖减慢、G1期停滞和衰老增加,提示CUL4B在调控细胞增殖和衰老中发挥重要作用。第二部分CUL4B通过转录抑制CDKNlA表达而调控细胞周期进展上部分结果显示,缺失Cul4b基因导致细胞增殖减慢、G1期停滞。有研究表明,在小鼠胚外组织细胞中敲除Cul4b导致p21累积,还有研究显示p21是CUL4A复合物的底物蛋白,可以被CUL4A泛素连接酶泛素化降解。为分析敲除Cul4b导致细胞增殖减慢的机制,我们首先检测了Cul4b基因敲除对p21表达的影响。结果如下：1、与野生型相比,Cul4b敲除的MEFs细胞中p21蛋白水平明显升高；对其mRNA进行检测发现其编码基因Cdknla的转录明显增加。在CUL4B低表达HEK293及HeLa稳筛细胞系中进一步验证,得到相同结果。2、由于p21的调控分为p53依赖和非依赖两种,而p53可以被CUL4A泛素连接酶泛素化降解。因此我们检测了CUL4B对CDKN1A的调控是否依赖于p53。首先,我们检测了CUL4B敲除或干扰后p53的mRNA及蛋白水平是否受到影响,结果发现降低CUL4B表达并不影响p53的表达水平；然后我们用p53抑制剂(Pifithrin-a)处理CUL4B低表达及其对照HEK293细胞,发现虽然p53抑制剂的处理可以明显降低p21的表达,但并不能阻止CUL4B干扰所引起的p21上调,说明CUL4B对CDKN1A的调控是p53非依赖的。3、为确定CUL4B对p21的调控是否通过蛋白降解通路,我们进行了两方面分析。一是采用放线菌酮(CHX)处理细胞,抑制新蛋白合成后分析p21的半衰期,结果发现抑制CUL4B表达并没有延缓p21的降解；二是用蛋白酶体抑制剂MG132处理CUL4B过表达及其对照细胞,发现CUL4B过表达会引起p21的降低,而MG132处理并不能阻止过表达CUL4B所引起的p21的下调。说明CUL4B只在转录水平调控CDKN1A,而不参与调控p21的蛋白降解。4、采用siRNA技术在Cul4b敲除MEFs细胞中干扰Cdknla,可以部分拯救由于CUL4B缺失所引起的增殖障碍。以上研究结果说明CUL4B可以通过负调控p21影响细胞周期,而CUL4B调控p21发生在转录水平,并且不依赖于p53。第三部分CUL4B与SIN3A/HDAC相互作用CDKNlA是SIN3A/HDAC的靶基因,该复合物可以结合在CDKNlA的启动子区域调控组蛋白乙酰化水平,从而抑制其表达。本实验室前期研究结果显示RbAp46/48可以通过DDB1与CRL4B复合物结合,而RbAp46/48也是SIN3A/HDAC复合物的核心组分。为了明确验证CRL4B与SIN3A/HDAC是否具有相互作用以及CUL4B对CDKNlA的调控是否通过SIN3A/HDAC复合物完成,我们进行了如下分析：1、首先通过免疫共沉淀(IP)实验检测到CUL4B以及DDB1能与SIN3A/HDAC复合物的核心组分HDAC1/HDAC2相互作用。进一步检测了SIN3A/HDAC复合物中的其他成员(SIN3A, SAP180, SAP130, SAP45, SAP30及RBP1),结果发现CRL4B复合物与SIN3A/HDAC复合物具有相互作用。2、为明确SIN3A/HDAC与CRL4B复合物的作用机制,我们进行了GSTpull-down实验,发现CUL4B和DDB1都能与SIN3A直接结合,而与其他成员(HDAC1/2, SIN3A, SAP180, SAP130, SAP45and SAP30)无直接结合。3、SIN3A蛋白分子量较大,在复合物中起到支架作用,可以与多种蛋白结合。我们根据其结构域将其截短为三段,分别命名S1,S2和S3。然后通过GSTpull-down实验我们发现CUL4B和DDB1与含有PAH3和HID结构域的S2直接结合。4、既然CRL4B与SIN3A/HDAC可以相互作用,我们猜测CRL4B可能通过SIN3A/HDAC复合物发挥组蛋白去乙酰化作用。为此我们首先纯化出CUL4B免疫沉淀复合物,发现该复合物中含有CRL4B及SIN3A/HDAC复合物的成员。之后我们进行了酶活实验,结果发现CUL4B免疫沉淀复合物确实能使组蛋白发生去乙酰化,并且该作用可以被HDAC抑制剂TSA所抑制。之后我们提取MEFs细胞及HeLa. HEK293细胞的组蛋白进行检测,结果发现CUL4B敲除或干扰后乙酰化组蛋白以及组蛋白特定位点的乙酰化水平均有所升高。该部分结果证明CRL4B与SIN3A/HDAC复合物具有相互作用,并且CRL4B通过SIN3A/HDAC复合物发挥使组蛋白去乙酰化的作用。第四部分CUL4B通过SIN3A/HDAC复合物抑制CDKN1A转录以上结果提示CUL4B对CDKN1A的调控可能是通过SIN3A/HDAC复合物实现的。为证明这一观点,我们做了以下实验：1、首先利用双荧光素酶报告基因系统分析发现CUL4B具有转录抑制作用,而且这种抑制作用可以被HDAC抑制剂TSA缓解。同时,干扰HDAC1/2也能减弱CUL4B的转录抑制作用。通过对该报告基因启动子区进行qChIP分析,我们发现CUL4B过表达会引起与该启动子区结合的DDB1、HDAC1/2以及SIN3A水平增加,同时伴有单泛素化H2AK119的富集和乙酰化组蛋白水平的降低。此外,TSA处理可以阻止CUL4B过表达所引起的p21表达下调；同时干扰SIN3A及CUL4B, p21的累积比单独干扰更为明显。2、之后我们在HEK293细胞系中进行了qChIP实验以确定CRL4B及SIN3A/HDAC复合物在CDKN1A启动子区的结合位置,结果发现CUL4B.DDB1、 HDAC1/2以及SIN3A可以结合在CDKN1A启动子区的相同位置。然后我们选结合最强的区域进行ChIP实验,进一步证明CRL4B及SIN3A/HDAC可以结合在p21的启动子区域,ChIP-Re/ChIP证明两个复合物结合在相同的位置。同样,在HEK293低表达的细胞系中进行qChIP实验,结果发现干扰CUL4B表达导致结合在CDKNlA启动子区的DDB1、HDAC1/2和SIN3A明显减少,同时伴有结合在该区域的单泛素化H2AK119的减少和乙酰化组蛋白水平的升高。而将HDAC1/2或SIN3A干扰后,与CDKNlA启动子结合的CUL4B和DDB1没有明显变化。说明CRL4B与CDKNlA启动子的结合先于SIN3A/HDAC复合物。3、我们选取了10个参与细胞周期调控的HDAC1/HDAC2的靶基因,采用定量RT-PCR方法分析这些基因在Cul4b敲除MEFs细胞中的表达情况,结果发现其中的5个基因在Cul4b敲除的MEFs细胞中明显上调。之后我们选其中一个,即Cdknlc (p57)进一步研究,发现与p21一致,CUL4B过表达导致p57表达降低,而干扰CUL4B表达导致其表达增加。ChIP实验也证明CRL4B及SIN3A/HDAC复合物结合在CDKNlC的启动子区,ChIP-Re/ChIP实验证明两种复合物结合在相同的位置。综上所述,我们发现CRL4B与SIN3A/HDAC复合物具有相互作用,共同结合在靶基因CDKNlA或CDKNlC的启动子区,通过单泛素化H2AK119和组蛋白去乙酰化,在转录水平抑制这些靶基因的表达,进而影响细胞周期进展。