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有机磷农药在农业生产中被广泛使用,由于多数有机磷农药属高毒、高残留类化合物,加上农药使用不合理,导致农产品中有机磷农药残留超标,严重危害着消费者的身体健康。传统的检测方法,如气相色谱法等,由于其处理过程的复杂性,检测周期较长等原因,无法满足现场快速检测的需要。因此,研究出方便、灵敏的快速检测技术是控制农药残留的重要手段之一。酶抑制检测法具有检测快速、设备和操作简单等特点,适合水果蔬菜的农药残留快速检测,受到基层机构的普遍欢迎。酶抑制法根据酶源的不同,分为动物胆碱酯酶抑制法与植物酯酶抑制法两种,其中动物胆碱酯酶法由于酶源范围窄、成本高,限制了其推广应用,而酶源丰富、廉价,取材方便的植物酯酶,近年来备受关注。
本研究在现有研究的基础上,扩大植物酶源筛选范围,选择大白豆为有机磷农药残留检测的酶源,优化了大白豆植物酯酶的提取工艺;研究了大白豆酯酶的纯化方法;系统探讨论了大白豆酯酶的特性;建立了有机磷农药检测方法体系。主要研究结果如下:
(1)通过对大白豆、绿豆、黄豆、小麦仁、荞麦仁、红花芸豆、黑芸豆、白芝麻、橡石、薏仁米10种植物种子中提取的酯酶的总酯酶活力、比活力及其对氧化乐果、敌敌畏、敌百虫3种毒性不同的有机磷农药的敏感性3个指标的比较,大白豆的总酯酶活力和比活力均高于其它9种,对有机磷农药的敏感性也较强,测定大白豆酯酶对氧化乐果、对硫磷、马拉对硫磷、敌敌畏、敌百虫、甲胺磷、乐果7种常见的有机磷农药的最低检测限,并与国家(欧盟)规定允许的最大残留限量(Maximum Residue Limit,MRL)比较,发现大白豆酯酶完全可以满足有机磷农药残留快速检测的需要。
(2)通过单因素实验以及响应面优化,得到大白豆酯酶最佳提取工艺为:大白豆种子粉碎后,按料液比1:5.04,以pH值7.04,浓度0.043mol/L的磷酸缓冲液为提取剂,搅拌95.51 min后,4℃静置过夜,8000r/min离心10 rain,大白豆酯酶总酯酶活力为9.84U/mL。
(3)大白豆酯酶粗酶液经2000r/min至8000r/min差速离心,60%硫酸铵盐析,DEAE-32离子交换层析以及Sephadex G-200凝胶过滤层析后,SDS-PAGE为一条带,纯化倍数达111.73,酶活回收率为43.9%。
(4)研究了大白豆酯酶的部分性质。研究表明,大白豆酯酶的最适温度为30℃,最适反应pH为7.5,该酶在温度25℃~40℃,pH6.5~8.0之间较为稳定。该酯酶对热不稳定,耐酸性不强。Hg2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ag+对该酶有强烈的抑制作用,其中Cu2+对此酶抑制作用最强,可使酶活抑制率达58.29%。Ca2+、Mn2+、Mg2+对大白豆酯酶活力几乎没有影响,Na+对其有一定的促进作用。大白豆酯酶的最适底物浓度为16mmol/L,双倒数作图法求得Km=0.280mmol/L。
(5)建立了利用大白豆酯酶测定部分有机磷农药残留的方法体系。即:酶液添加量为20mL/L,加入α-乙酸萘酯丙酮溶液后,混合均匀,在30℃水浴中反应10分钟,再加入0.5mL固兰B盐溶液,混合均匀后,在30℃水浴中显色10分钟,并在10分钟之内完成595 nm波长处吸光度的测定。