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本文旨在以硅氧烷纳米材料作为基础,引入阳离子聚合物,制备有机-无机杂化纳米基因载体。本文工作主要分为以下三个方面:
1.以羧甲基壳聚糖、有机硅烷(GPSM)作为反应物,以氨水作为反应介质,在水相中制得羧甲基壳聚糖-硅氧烷(CMG)纳米颗粒。采用电子透射显微镜及粒径仪对CMG纳米颗粒的形貌、尺寸和表面电位进行表征。通过红外光谱、热失重分析等方法,对CMG纳米颗粒的结构进行了分析,并探讨了该基因载体的合成机制。为了提高该载体的功能性及结合DNA的能力,通过共价键连的方法将具有逃逸溶酶体功能的KALA活性多肽修饰到CMG纳米颗粒表面(CMG-KALA)。通过激光共聚焦、荧光光谱以及红外光谱证明KALA可以成功地连接到CMG纳米颗粒表面;通过静电引力吸附将DNA与CMG-KALA纳米颗粒进行复合,并通过琼脂糖凝胶电泳证明该纳米颗粒对DNA具有很好的保护作用。因此CMG-KALA纳米颗粒具有作为基因载体应用到体外转染实验的潜力。
2.在本课题组前期工作的基础上,为了赋予明胶硅氧烷(GS)纳米颗粒更多的功能性,分别制备了具有穿膜作用、逃逸溶酶体作用以及核定位作用的多肽修饰的GS纳米颗粒,并通过静电吸附的方法将DNA与GS-peptide纳米颗粒进行复合。通过荧光光谱确定了纳米颗粒上不同多肽的连接率;通过粒径仪分析GS-peptide纳米颗粒的粒径及表面电位,并通过DNAstar分析软件对不同多肽的二级结构进行了模拟,确定了其发生螺旋及两亲性的氨基酸序列;通过激光共聚焦显微镜和琼脂糖凝胶电泳确定GS-peptide纳米颗粒与DNA的结合能力,进而筛选出最适合提高GS纳米颗粒DNA结合能力的多肽序列。
3.根据本课题组前期对GS-Tat纳米颗粒的研究,以GS-Tat纳米颗粒为基因载体,以β-半乳糖苷酶为表达基因,对此基因体系进行小鼠体内生物分布和体内基因表达的研究,从而进一步确定其作为基因治疗体系的可行性。