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本研究建立了牛诱导性多能干细胞系(induced pluripotent stem cells, iPS cells)。本研究克隆牛Nanog与Lin28两个转录因子基因,以逆转录病毒载体pMSCVneo携带牛Oct4, Sox2, Nanog与Lin28四个转录因子,诱导成年奶牛皮肤成纤维细胞重编程为牛iPS细胞。为研究牛多能性干细胞生物学特性和牛体细胞重编程机理,提供了理论依据和试验基础。本研究获得以下主要结果：1.克隆得到牛Nanog与Lin28两个转录因子开放性阅读框(ORF)全序列。从50-60日龄牛胎儿体内分离原始生殖嵴组织(PGR),经RT-PCR扩增,获得牛Nanog基因与Lin28基因ORF全序列。经过鉴定与测序,并与GenBank中参考序列进行变异分析,证明所克隆牛Nanog基因与Lin28基因ORF全序列与参考序列同源性均为100%,没有发生碱基突变。2.牛Nanog基因与Lin28基因逆转录病毒表达载体的构建及其包装。(1)经过酶切、连接、转化与鉴定,成功构建了包含牛Nanog基因与Lin28基因ORF全序列的逆转录病毒表达载体：pMSCV-Nanog (MN)与pMSCV-Lin28 (ML).(2)重组逆转录病毒质粒MN与ML,经过PT67包装细胞包装,产生具有感染性的病毒颗粒；以NIH3T3细胞作为指示细胞,测定MN与ML的最高感染滴度分别为9.19×107cfu/mL与7.5×107cfu/mL。病毒颗粒在透射电镜下呈现球形与椭球形,直径约为50-100 nm。病毒上清经过二次感染NIH3T3细胞,RT-PCR在NIH3T3细胞上清中,没有检测出野生型病毒颗粒存在。说明逆转录病毒在包装细胞系以外其他细胞内,不能复制包装。3.特定转录因子诱导成年牛皮肤成纤维细胞为iPS细胞并鉴定其生物学特性。(1)以成年雌性Holstein奶牛皮肤组织为材料,通过组织块培养与差速贴壁法,分离纯化得到牛皮肤成纤维细胞(bovine dermal fibroblasts, BDFs)。测定BDFs生长曲线、群体倍增时间与细胞周期等生物学特征；BDFs表达波形蛋白(Vimentin)与纤维连接蛋白(Fibronectin)等成纤维细胞的特异性标志蛋白。(2)以逆转录病毒pMSCVneo为载体,携带牛源性Oct4, Sox2, Nanog与Lin28四个转录因子转染BDFs,成功获得牛iPS细胞系。诱导后平均20.75 d完成重编程,平均重编程效率为0.034%。用脱细胞人羊膜(cell-free HAM)作牛iPS细胞培养支架,代替小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,建立牛iPS细胞无饲养层细胞的培养体系,其效果良好。(3)牛iPS细胞生物学特性鉴定：牛iPS细胞与ES细胞生长行为类似,呈集落样生长,AKP染色为阳性。牛iPS细胞强表达SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60与TRA-1-81等多能性干细胞表面标志；同时表达Oct4, Sox2, Nanog与TERT多能性干细胞特异性蛋白；但不表达SSEA-1与CD117标志蛋白。牛iPS细胞核型为60条XX二倍体核型,符合雌性奶牛细胞的染色体形态与数目标准。牛iPS细胞冻存液以70%牛iPS细胞培养液+20%FBS+10%DMSO效果较好,解冻后其平均存活率为90.9%。4.牛iPS细胞的多能性鉴定。(1) RT-PCR检测牛iPS细胞表达Oct4、Nanog、Sox2、c-Myc、Klf4与Lin28等多能性相关基因；转染的外源性基因在牛iPS细胞中表达微弱或发生沉默。qPCR测定牛iPS细胞中Oct4、Nanog、Sox2、Lin28与TERT基因的表达量显著增加,超出BDFs的103-104倍,c-Myc与Klf4表达量比BDFs增加5-10倍。牛iPS细胞不同代次之间的基因表达量没有显著差异。牛iPS细胞Oct4基因与Nanog基因启动子区域表现为高度去甲基化状态,与多能干细胞甲基化模式类似。Western blotting检测牛iPS细胞能够表达Oct4、Nanog、Sox2、Lin28与Klf4蛋白质。(2)将牛iPS细胞体外悬浮培养7 d,能够形成圆球状与囊腔状类胚体(EBs)结构。EBs贴壁培养后,能够自由分化为纤维样细胞、多突起的神经样细胞与铺路石状的上皮样细胞。免疫细胞化学染色表明,EBs能自由分化为表达AFP,CK7与PDX-1阳性的内胚层细胞；表达a-Actin与Vimentin阳性的中胚层细胞；表达βⅢ-tubulin, Nestin与GFAP阳性的外胚层细胞。通过EBs介导,牛iPS细胞在分别添加全反式维甲酸(RA)和p巯基乙醇(p-Me)两种诱导条件下,均可定向分化为Nestin、GFAP与NSE表达阳性的神经细胞。证明牛iPS细胞在体外具有多分化潜能。(3)将1.3×106个牛iPS细胞,注射到裸鼠皮下形成畸胎瘤。组织切片观察,畸胎瘤组织内包含有横纹肌、腺体、脂肪组织与神经节样组织结构。从畸胎瘤中,RT-PCR扩增出代表三个胚层分化细胞的特异性基因。证明牛iPS细胞在裸鼠体内具有发育多能性。(4)将1.1×106个牛iPS细胞,注射入两只妊娠55天的萨能奶山羊胎儿腹腔,妊娠足月后分娩,其中一只受体母山羊产下1只具有明显的皮毛嵌合体羔羊。经PCR方法对嵌合体羔羊各组织中牛细胞线粒体DNA序列检测,证明嵌合体羔羊体内多数组织中包含有牛细胞。证明牛iPS细胞参与嵌合体动物形成。