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目的(1)探索分步离心结合超速离心的方法能否成功分离缺氧预处理条件下大鼠骨髓间充质干细胞分泌的exosome。(2)分析获取缺氧预处理下骨髓间充质干细胞分泌的exosome颗粒的直径分布范围、平均半径等特征。(3)探索心肌细胞H9C2是否是缺氧预处理条件下骨髓间充质干细胞分泌的exosome的生物学作用靶细胞之一。(4)探索缺氧预处理条件下骨髓间充质干细胞分泌的exosome被心肌细胞H9C2摄取的时间特征。方法(1)采用目前成熟的方法提取大鼠骨髓间充质干细胞原代,培养并传代纯化至3-6代。(2)采用目前公认的方法对骨髓间充质干细胞进行缺氧预处理,进一步地,采用分步离心结合超速离心的方法分离提取培养上清液中干细胞分泌的exosome囊体颗粒。(3)采用低分辨率透射电镜直接观察提取物的特征,以最直观的方式鉴定提取物是否为exosome,并为进一步的获取exosome这种微型囊体的特征性数据奠定基础。(4)采用SDS-PAGE凝胶电泳系统来检测提取物exosome颗粒中CD63分子和CD9分子的表达情况,以鉴定提取物是否为exosomes。(5)根据透射电镜鉴定结果,本实验采用图像分析软件Image-Pro Plus6.0对透射电镜图片中exosome的数据进行采集,采用Excel作图工具和统计分析软件Graph Pad5.0对采集得到的exosome颗粒数据进行统计,以首次获得大鼠骨髓间充质干细胞来源的exosomes的直径分布区间和平均半径等特征.(6)采用绿色荧光染料PKH-67对exosome进行荧光染色标记,将标记的exosome与心肌细胞H9C2共孵育,荧光显微镜下示踪观察exosome能否够被心肌细胞H9C2摄取,以明确心肌细胞是否是干细胞来源exosome勺生物学作用靶点之一。进一步,将标记的exosomes与心肌细胞H9C2共孵育不同的时间段,以探索exosome被心肌细胞H9C2摄取的情况随时间的变化特征。结果(1)透射电镜随机视野下可以看到提取物呈微型囊体结构,形态近似球形或者椭球形,大小均一,均匀分散的分布在视野中,故可以排除提取物是蛋白质的可能性。(2)据报道凋亡小体是凋亡细胞程序性裂解后产生的细胞碎片,其直径分布范围为100-1000nm,经透射电镜随机视野观察,本实验提取物直径集中分布在20-60nm范围,故又可排除提取物是凋亡小体的可能性。(3) Western blot鉴定结果显示,本提取物均阳性表达CD63和CD9分子,且较CD63分子,缺氧预处理培养下,大鼠骨髓间充质干细胞exosomes更高表达CD9分子。据此鉴定结果,我们可以排除该提取物为microvesicle(?)micropaticle的可能性。因此可以证明提取物即是exosomeso(4)经图像分析软件Image-Pro Plus6.0(?)excel数据分析显示,大鼠骨髓间充质干细胞来源的exosomes直径在20-60nm左右,且分布比较集中。(5)经Graph Pad5.0统计学软件对分离提取的大鼠骨髓间充质干细胞来源的exosomes进行半径和直径的统计学分析,我们证明,缺氧预处理条件下,骨髓间充质干细胞exosome最小半径2nm,最大半径31nm,半径25%分位数为13nm,半径75%分位数为21nm,半径中位数为17nm,exosome半径平均数±标准差为17.03±0.4016nm。(6)Exosome与心肌细胞H9C2共孵育实验结果显示,仅实验组H9C2细胞质内可见大量的exosomes绿色荧光颗粒。(7)探索H9C2摄取exosomes的时间特征的实验中,通过对照组4个亚组和实验组0+2h、0+3h、0+4h亚组,我们排除了荧光标记的exosome荧光颗粒数量和荧光强度随时间的自发淬灭现象对实验结果的影响,明确了H9C2细胞质内的exosome颗粒数量仅与exosome和H9C2共孵育的时间相关。实验组各亚组显示,标记的exosome和心肌细胞H9C2共孵育1h,H9C2细胞质中即开始观察至exosome绿色荧光颗粒,exosome与H9C2共孵育1.5-2.5h,H9C2细胞质中exosome绿色荧光颗粒数量较其他亚组多,荧光强度较其他亚组强。结论经过透射电镜(?)western blot鉴定证明,本实验采用分布离心结合蔗糖／重水垫超速离心的方法,成功的提取到了缺氧预处理条件下的骨髓间充质干细胞exosomes;并且证明该分离提取方法具有较为理想的效果；通过excel和Graph Pad5.0统计分析,我们首次明确了缺氧预处理条件下,骨髓间充质干细胞exosome直径分布集中在20-60nm区间,平均直径为34.06nnm；通过exosome和心肌细胞H9C2的共孵育实验,我们证明了缺氧预处理的骨髓间充质干细胞exosomes能被心肌细胞H9C2高效率地摄取,因此可以明确,心肌细胞H9C2是骨髓间充质干细胞exosome的生物学作用靶细胞之一；同时我们证明,骨髓间充质干细胞exosomes和心肌细胞H9C2共孵育1.5-2.5h后,心肌细胞对exosome的摄取量达到高峰。